Development and validation of a method for simultaneous determination of pseudouridine and creatinine in human urine. Evaluation’s Index Pseudouridona/Creatinine in smokers and no-smokers

RESUMEN

Introduction: The excretion of pseudouridine is increased in inflammatory processes related to a muscle mass loss found in patients with pulmonary involvement. Material and Methods: A rapid and sensitive method for cuantification and simultaneous determination of pseudouridine, a breakdown product of tRNA, and creatinine in human urine via HPLC was developed and validated. The mobile phase was 0.01 mol phosphate buffer (pH 6.1) containing 3 mmol octanesulphonic acid as ion pairing agent. Sample preparation is based on dilution and filtration. A LiCHros-pher® 100 RP-18 (5 μm) LiCHroCART® 250-4 (Merck) column with precolumn LiCHrospher® 100 RP-18 (5 μm) LiCHroCART® 50-4 (Merck) were used, flow rate of 1ml/min. Detection wavelength was set at 250 nm. Results: The analysis time was 17 min per sample. The calibration range of pseudouridine (Psu) and creatinine (Crea) were 0.23-22.5 and 11.45-1100 nmol/ml. The linearity of the method was r2 = 0.997 and 0.998 and the lower limit of quantification (LLOQ) was 0.175 and 8.59 nmol/ml respectively. The average recovery (%) was 95.55 for pseudouridine and 97.82 for creatinine by addition and 93.16 and 89.79 % by dilution. The estimation of the coefficients of variation were < 8% for all levels. Conclusions: A positive correlation was found between expected and observed values (Pearson correlation coefficient = 0.99 for pseudouridine and 0.99 for creatinine). A correlation was found between recovery of pseudouridine and recovery of creatinine (Pearson correlation coefficient = 0.86). This method was used to assess pseudouridine excretion in 30 healthy subjects (18 non-smokers and 12 smokers). There were no statistically differences between non-smokers and smokers (AU)

ABSTRACT

Introdución La excreción de pseudouridina, está incrementada en procesos inflamatorios relacionados con pérdida de masa muscular encontradaen pacientes con afectación pulmonar. Material y Métodos: Se desarrolla y valida, un método, mediante HPLC, para la determinación simultanea de pseudouridina y creatinina en orina. Como fase estacionaria se utilizó una columna LiCHrospher® 100 RP-18 (5 μm) LiCHroCART® 250-4 (Merck). Fase móvil consistente en un tampón fosfato 0,01 M (pH = 6,1) conteniendo octanosulfónico 3mmol como agente de par iónico, y longitud de onda de 250 nm. La preparación de la muestra se basa en una dilución y filtración. La linealidad del método fue satisfactoria dentro del rango de concentración de 0,23-22,5 nmol/ml para pseudouridina y 1,45-1100 nmol/ml para creatinina, con límites de cuantificación de 0,175 y 8,59 nmol/ml, respectivamente. Resultados: La recuperación media fue del 95,55% para Pseudouridina y del 97,82% para Creatinina en la validación de adición de estándar interno y de 93,16 y 89,79% en la de dilución. Los coeficientes de variación fueron < del 8% en todos los niveles. Se encontró una correlación entre los valores encontrados y los esperados (coeficiente de correlación de Pearson de 0,99). Conclusiones: Existe correlación entre las recuperaciones de pesudouridina y creatinina, coeficiente de correlación de Pearson de 0,86. El método desarrollado, es rápido, sensible y selectivo para la simultanea determinación de pseudouridina y creatinina en orina humana. En este estudio preliminar con 30 voluntarios sanos, 18 no fumadores y 12 fumadores, no se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos con respecto a la excreción de pseudouridina (AU)