Isolamento e caracterizaçäo das fosforribosiltransferases do Trypanosoma cruzi / Isolation and characterization of phosphoribosyltransferases of Trypanosoma cruzi

RESUMO

Preparou-se um extrato de epimastigotos de T. cruzi por congelaçäo/degelo e centrifugaçäo a 100.000 x g. O sobrenadante, contendo adenina (A), hipoxantina (H), xantina (X) e guanina (G) fosforribosiltransferases (PRTases), foi colocado em coluna de afinidade de GMP-agarose e lavado com soluçäo aquosa de 500 mM de KCl, 100 mM de Tris, 40 mM de MgCl2 de D,L-ditiotreitol (DTT). A seguir, a coluna foi eluída com soluçäo aquosa l mM de 5-fosforribosilpirofosfato (PRPP). Observou-se atividade de APRTase na fraçäo que saiu com as proteínas e atividade de H, X e GPRTase em pico único observado algum tempo após. Determinaram-se os valores de KM para H (3,8 micron M), G (3,2 micron M) e X (= 300 micron M). Determinaram-se também valores de Ki aparente para a inibiçäo competitiva das purinas. Por exemplo, a G inibe a açäo da H*PRTase com valor de Ki = 3,2 micron M e H inibe a açäo da G*PRTase com valor de Ki = 3,3 micron M. Esse resultado leva à conclusäo de que H e G ligam-se ao mesmo sítio ativo. A atividade das quatro PRTases é suscetível à inibiçäo pelo ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB). As velocidades de inibiçäo para H, G e XPRTases säo praticamente idênticas (0,21, 0,23 e 0,21 min-1), enquanto que para a APRTase é muito maior (cerca de 90 min-1). Esses resultados, em conjunto, sugerem que as atividades de H, X e GPRTases se encontrem numa única enzima, distinta da APRTase