In vitro culture, PCR, and nested PCR for the detection of Theileria equi in horses submitted to exercise / Cultivo in vitro, PCR e nested PCR na detecção de Theileria equi em eqüinos submetidos a exercícios

ABSTRACT

This study compared the usefulness of in vitro culture, PCR, and nested PCR for the diagnosis of Theileria equi in horses submitted to stress during exercise. Blood samples from 15 apparently healthy horses, previously conditioned to a high-speed equine treadmill, were taken prior to and after exercise. The animals were divided into two experimental groups 30-day training schedule (G1) and 90-day training schedule (G2). Statistical analysis was performed using a chi-square test and kappa statistic was used in order to assess agreement. No significant difference was observed between samples collected at resting or after exercise. In G1, merozoites of T. equi were detected in the blood smears of four horses before in vitro culture, whereas 14 samples were positive, confirmed by culture. In G2, five and 11 horses were positive before and after culture, respectively. No PCR amplified product was observed in any of the tested animals although the PCR system based on the 16S rRNA gene of T. equi detected DNA in blood with an equivalent 8x10-5 percent parasitaemia. The nested PCR based on the T. equi merozoite antigen gene (EMA-1) allowed the visualization of amplified products in all the horses. Therefore, nested PCR should be considered as a means of detection of sub-clinical T. equi infections and in vitro culture could be used as a complement to other methods of diagnosis.

RESUMO

Comparou-se a utilização do cultivo in vitro, PCR e nested PCR no diagnóstico de Theileria equi em eqüinos submetidos ao estresse induzido por exercícios. Amostras de sangue foram obtidas de 15 eqüinos submetidos a treinamento em esteira rolante de alto desempenho, sendo as amostras colhidas antes e após os exercícios. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais 30 dias de treinamento (G1) e 90 dias de treinamento (G2). O teste do qui-quadrado foi empregado para as análises estatísticas e o índice kappa utilizado para avaliar a concordância. Não houve diferença significativa entre as amostras obtidas em repouso e após exercícios. Merozoítas de T. equi foram detectados em apenas quatro eqüinos do G1 pela microscopia direta realizada antes do cultivo, enquanto 14 animais apresentaram-se positivos pelo cultivo in vitro. No G2, cinco e 11 eqüinos foram positivos antes e após o cultivo, respectivamente. Nenhum produto de amplificação foi observado pela técnica de PCR, apesar do PCR baseado no gene 16S rRNA de T. equi ter detectado DNA em sangue com parasitemia equivalente a 8x10-5 por cento. O nested PCR, baseado na seqüência do gene do antígeno de merozoíta de T. equi (EMA-1,) permitiu a visualização de produtos de amplificação em todos os eqüinos testados. O nested PCR deve ser considerado para a detecção de infecções subclínicas de T. equi e o cultivo in vitro pode ser utilizado como uma ferramenta complementar a outros métodos de diagnóstico.