Adaptação da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) quantitativa em tempo real para o diagnóstico da leucoencefalopatia multifocal progressiva (LMP) / Adapting the technique of polymerase chain reaction (PCR) quantitative real-time diagnosis of progressive multifocal leukoencephalopathy (PML)

RESUMO

A leucoencefalopatia multifocal progressiva (LMP), doença subaguda desmielinizante do sistema nervoso central (SNC), é causada pelo Poliomavirus Humano JC (JCPyV). Devido ao uso de terapias imunossupressoras e à SIDA a frequência de casos de LMP aumentou consideravelmente nas últimas décadas. O padrão ouro para o diagnóstico da LMP é a biópsia cerebral. Entretanto, apesar do elevado poder diagnóstico, este é um método invasivo, com uma taxa custo/benefício elevada. Assim, utiliza-se a tomografia computadorizada ou a ressonância magnética do crânio para o diagnóstico presuntivo de LMP. Métodos moleculares, em especial a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm se mostrado eficiente no diagnóstico de várias doenças virais do SNC. A nested-PCR (nPCR) é uma técnica mais eficaz na detecção do DNA do JCPyV no liquidocefalorraqueano (LCR), proporcionando maior sensibilidade e especificidade quando comparada à PCR convencional. Entretanto, aproximadamente 15 por cento dos casos prováveis de LMP podem não se confirmar pela nPCR. Na era da terapia antiretroviral altamente potente (HAART), o percentual de casos não confirmados aumentou, chegando à aproximadamente 42 por cento. Publicações recentes nas quais se utilizou a PCR quantitativa (qPCR) em tempo real demonstram que esta técnica pode ser 10 vezes mais sensível quando comparada à PCR convencional na detecção e quantificação do JCPyV, podendo também ser utilizado como um marcador virológico em pacientes em uso de HAART com diagnóstico de LMP. Neste trabalho, elaboramos uma técnica que permite quantificar a carga viral do JCPyV no LCR de pacientes com LMP em razão de acompanhar a resposta do paciente ao tratamento com a HAART. O princípio da técnica qnPCR em tempo real estabelecida foi semelhante ao da nPCR, sendo constituído por dois passos de amplificação sequenciados. O primeiro passo trata-se de uma PCR convencional seguido de nova amplificação, agora utilizando a técnica de qPCR em tempo real e tendo como molde o produto da primeira amplificação. Foram analisadas amostras de LCR armazenadas pelo Laboratório de Pesquisa Clínica em Neuroinfecções. Destas, 16 eram de pacientes com confirmação diagnóstica pelo método de nPCR e 10 eram de casos compatíveis mas sem diagnóstico. Pela qnPCR em tempo real, nenhum dos casos compatíveis com LMP apresentou quantificação de carga viral e das 16 amostras positivas, apenas 12 apresentaram sinais de carga que ultrapassaram a linha de base apontando a presença do DNA do JCPyV. Em nossa casuística a nPCR teve sensibilidade de 69,6 por cento enquanto a sensibilidade da qnPCR foi de 52,2 por cento. Concluímos que a questão diagnóstica da LMP ainda persiste, pois não conseguimos aumentar a sensibilidade de detecção do JCPyV no LCR, entretanto, desenvolvemos um método quantitativo que poderá auxiliar como dado da resposta do paciente ao tratamento com a HAART.