Desenvolvimento e validação de ferramentas moleculares para análise da resposta imune de primatas Aotus e Saimiri / Development and validation of molecular tools to analyse the immune response in the Aotus and Saimiri neotropical primates monkeys

Os primatas neotropicais Aotus e Saimiri são os modelos recomendados pela OMS para estudos experimentais usando parasitas da malária humana. No entanto, existe uma carência de ferramentas específicas para estudar a resposta imune desses primatas durante o curso de infecção. A PCR quantitativa em tempo real (PCR-TRq) permite avaliar a expressão gênica nesses modelos e, assim, auxiliar no entendimento dos mecanismos imunológicos e geradores de patogenia nessa endemia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenhar, amplificar, sequenciar e analisar fragmentos de genes relacionados à resposta imune de A. infulatus e S. sciureus, para desenhar iniciadores moleculares para PCR-TRq visando à avaliação da expressão desses genes durante imunizações e infecção por P. falciparum. Para esse fim, sequências de DNA humano de 31 moléculas foram obtidas do GenBank para servir como molde para o desenho dos iniciadores usados na PCR convencional e na PCR-TRq e para o sequenciamento de DNA genômico de Aotus e Saimiri. As sequências foram analisadas no aplicativo BioEdit e usadas como molde para desenhar iniciadores específicos para o estudo de expressão gênica por PCR-TRq. Uma cinética de expressão gênica foi realizada estimulando-se células mononucleares do sangue periférico de Saimiri e Aotus com mitógenos por 2, 4, 6, 8, 12 e 18 horas. Depois, os iniciadores específicos foram usados na avaliação de resposta imune em células de baço de macacos Saimiri infectados por P. falciparum cultivadas sob diferentes condições antigênicas. Desse modo, 17 (IFNgama, TNF, LTA, IL2, IL6, IL10, IL12, IL3, IL4, IL5, IL13, TGFbeta2, CD40, CSF2, CCR5, CCR8 , e BAX) dos 31 genes analisados foram amplificados, purificados e sequenciados. Graus de identidade, que variaram de 87% a 100%, foram observados entre as sequências nucleotídicas de Aotus, Saimiri, outros primatas e do homem. As sete moléculas (IFNgama, IL2, IL6, IL10, IL12, LTA e TNF) analisadas nas reações de PCR-TRq mostraram pico de expressão que variou entre seis e 12 horas; constatamos que as hemácias parasitadas corresponderam ao melhor estímulo antigênico. A análise da expressão dessas moléculas em esplenócitos de Saimiri infectados evidenciou uma forte reação inflamatória com sete dias de infecção, quando já se observava uma desestruturação da arquitetura normal nesse órgão. Com 28 dias de infecção, notou-se uma diminuição da expressão desses genes que coincidiu com uma reestruturação da arquitetura do baço, que se apresentava ainda com regiões de congestão da microcirculação e forte deposição de hemozoína. Concluímos que variações de sequência existentes entre espécies correlatas, mesmo que pequenas, podem interferir no reconhecimento de transcritos durante os ensaios de expressão gênica, reforçando a necessidade de se desenvolver ferramentas moleculares específicas para Aotus e Saimiri para avaliação de resposta imune. Finalmente, nossos dados de expressão gênica de citocinas corroboraram aqueles obtidos em estudos com humanos, nos quais uma forte reação inflamatória durante os estágios iniciais de infecção foi seguida por uma inibição dessa resposta, o que corresponde ao padrão de resposta imune importante para o controle do crescimento do parasita e consequente redução das complicações associadas à imunopatogenia.

Severe anemia affects both splenectomized and non-splenectomized Plasmodium falciparum-infected Aotus infulatus monkeys

Severe anemia is the earliest and a frequently fatal complication of Plasmodium falciparum infection. Here we describe Aotus infulatus as a primate model suitable to study this malaria complication. Both non-splenectomized and splenectomized monkeys receiving different inocula of P. falciparum FVO strain presented large (> 50 percent) decreases in hematocrit values during infection. Non-splenectomized animals were able to control parasite growth (parasitemia did not exceed 4 percent), but they had to be treated because of severe anemia. Three of 4 splenectomized monkeys did not control parasitemia and were treated, but developed severe anemia after treatment when presenting a negative blood film. Destruction of parasitized red blood cells alone cannot account for the degree of anemia. Non-splenectomized monkeys repeatedly infected with homologous parasites became rapidly and progressively resistant to reinfection and to the development of severe anemia. The data presented here point to A. infulatus as a suitable model for studying the pathogenesis of severe malarial infection

Estudo da suscetibilidade e da vulnerabilidade do primata neotropical Aotus infulatus À infecção pelo Plasmodium falciparum e sua utilização na avaliação pré-clínica de dois antígenos candidatos à vacina antimalárica / Study of the susceptibility and the vulnerability of the neotropical primate Aotus infulatus to the infection for the Plasmodium falciparum and its use in the evaluation daily pay-clinic of two antigens candidates to the antimalarial vaccine

A malária continua sendo uma das doenças mais prevalentes no mundo necessitando de uma estratégia de controle alternativa para controlar a transmissão da doença. Porém, grandes obstáculos como a complexidade do parasita e a falta de modelos experimentais que reproduzam fidedignamente a infecção por plasmódios humanos e suas conseqüências entravam o descobrimento de tal vacina. Este trabalho teve por objetivo caracterizar a susceptibilidade e o curso da infecção por P. falciparum em macacos A. infulatus e avaliar seu uso para testes pré-clínicos de vacinas e para estudos da patogenia da anemia grave. No estudo de susceptibilidade infectamos dois grupos de cinco animais não-esplenectomizados com 5x104 hemácias parasitadas (hp) ou 5x105 hp mensurando diariamente parasitemia e temperatura retal, e hematócrito a cada três dias. Não houve correlação entre inóculo, parasitemia e anemia grave, pois os dois grupos tiveram curso de parasitemia semelhantes com desenvolvimento de anemia grave em nove animais. Três meses após o tratamento da primeira infecção, todos os animais receberam 1.000.000 hp. pela mesma cepa e foi demonstrado que se tornaram bastante resistentes a uma infecção secundária. No experimento de imunogenicidade utilizamos A. infulatus esplenectomizados em paralelo com S. sciureus. Os grupos foram imunizados cinco vezes com GLURP/R0-Alume ou MSP3/TLP -AS02 ou –PMC, e receberam uma dose de reforço com GLURP/R0-Montanide ISA720 ou MSP3/C-terminal-AS02. As formulações vacinais mostraram ser imunogênicas. Os animais foram infectados com inóculo de 5x104 hp pela cepa FVO de P. falciparum (Aotus) e cepa FUP (Saimiri). Porém os S. sciureus não se infectaram e tiveram que ser novamente inoculados com 5x105 hp pela cepa FUP (P. falciparum). Apesar de alguns Aotus vacinados apresentarem retardos no crescimento da parasitemia em relação aos controles, não foi possível evidenciar efeitos protetores evidentes induzidos pelas imunizações. Em conclusão, demonstramos que A. infulatus é susceptível à infecção e à anemia malárica grave por P. falciparum independente de possuírem ou não baço e tornam-se progressivamente resistente à infecção e à anemia grave já na segunda infecção. A espécie A. infulatus mostrou ser um bom modelo para estudos de malária e suas conseqüências, particularmente a anemia malárica grave, sendo também recomendada para estudos de imunogenicidade de antígenos candidatos a compor uma vacina antimalárica.