Análisis comparativo de la actividad antimicrobiana de secreciones y excreciones larvarias de Calliphora vicina y Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae) / A comparative analysis of Calliphora vicina and Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae) larval secretions and excretions antimicrobial activity

Introducción. La creciente resistencia bacteriana a los antibióticos representa una amenaza mundial de salud pública. Las excreciones y secreciones larvarias derivadas de moscas necrófagas de la familia Calliphoridae podrían configurar una fuente promisoria para contrarrestar sus efectos. Objetivo. Comparar la actividad antimicrobiana de las excreciones y secreciones larvarias nativas, y de las mayores y menores de 10 kDa de Calliphora vicina y Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae). Materiales y métodos. El bioensayo se hizo a partir de la técnica de turbidimetría y en el caso de las excreciones y secreciones menores de 10 kDa se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM). Resultados. Las excreciones y secreciones nativas y las menores de 10 kDa de C. vicina y S. magellanica, evidenciaron una potente actividad antibacteriana contra tres cepas de Staphylococcus aureus y cuatro bacterias Gram negativas, siendo las menores de 10 kDa más efectivas que las nativas en las dos especies de moscas evaluadas. Además, las menores de 10 kDa presentaron la misma efectividad, aunque en las pruebas de CIM se observó que las de S. magellanica fueron más potentes en todas las bacterias evaluadas, excepto contra la cepa de S. aureus ATCC 25923. Las mayores de 10 kDa no inhibieron el crecimiento bacteriano. Conclusión. Los resultados validaron, en general, que estas sustancias son fuente importante para el aislamiento y la caracterización de agentes antimicrobianos.

Introduction: The growing resistance to antibiotics worldwide represents a global threat to public health. The larval excretions and secretions derived from necrophagous flies from the Calliphoridae family could represent a promising source for counteracting their effects. Objective: To compare the antimicrobial activity of Calliphora vicina and Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae) native excretions and secretions and those weighing more than 10 kDa and less. Materials and methods: We used the turbidimetry technique for the bioassay; we determined the minimum inhibitory concentration (MIC) for excretions and secretions weighing less than 10 kDa. Results: Calliphora vicina and S. magellanica native excretions and secretions and those weighing less than 10 kDa exhibited potent antibacterial activity against three Staphylococcus aureus strains and four Gram-negative bacteria; those weighing less than 10 kDa were more effective than the native ones in the two species of flies evaluated here. Furthermore, excretions and secretions weighing less than 10 kDa had the same effectiveness, except in the MIC trials where S. magellanica excretions and secretions weighing less than 10 kDa were more potent against all the bacteria evaluated, except for S. aureus ATCC 25923. Excretions and secretions weighing more than 10 kDa did not inhibit bacterial growth. Conclusions: These results potentially validate these substances as an important source for isolating and characterizing antimicrobial agents.

Characterising four Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae) larval fat body-derived antimicrobial peptides

BACKGROUND The inappropriate use of antibiotics has led to the accelerated growth of resistance to antibiotics. The search for new therapeutic strategies (i.e., antimicrobial peptides-AMPs) has thus become a pressing need. OBJECTIVE Characterising and evaluating Sarconesiopsis magellanica larval fat body-derived AMPs. METHODS Fat body extracts were analysed by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC); mass spectrometry was used for characterising the primary structure of the AMPs so found. ProtParam (Expasy) was used for analysing the AMPs' physico-chemical properties. Synthetic AMPs' antibacterial activity was evaluated. FINDINGS Four new AMPs were obtained and called sarconesin III, IV, V and VI. Sarconesin III had an α-helix structure and sarconesins IV, V and VI had linear formations. Oligomer prediction highlighted peptide-peptide interactions, suggesting that sarconesins III, V and VI could form self-aggregations when in contact with the microbial membrane. AMPs synthesised from their native molecules' sequences had potent activity against Gram-positive bacteria and, to a lesser extent, against Gram-negative and drug-resistant bacteria. Sarconesin VI was the most efficient AMP. None of the four synthetic AMPs had a cytotoxic effect. MAIN CONCLUSIONS S. magellanica larval fat body-derived antimicrobial peptides are an important source of AMPs and could be used in different antimicrobial therapies and overcoming bacterial resistance.

Evaluación del efecto tóxico de extractos de Eupatorium microphyllum L.F. (Asteraceae) sobre larvas de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) en condiciones de laboratorio / Evaluation of the toxic effect from Eupatorium microphyllum L.F. (Asteraceae) extracts on Aedes aegypti larvae (Diptera: Culicidae) in laboratory conditions

En el presente trabajo se evaluó la actividad tóxica de extractos de Eupatorium microphyllum L.F. sobre larvas de IV estadio del mosquito Aedes aegypti (Linneaus), bajo condiciones de laboratorio. Se utilizaron extractos acuosos en concentraciones del 500 mg L-1, 1.500 mg L - 1 y 2.500 mg L-1 y acetónicos en concentraciones de 10 mg L-1, 20 mg L-1, 30 mg L-1, 40 mg L-1 y 50 mg L-1. Los bioensayos se realizaron por triplicado, cada uno con 20 larvas, expuestas durante 24 horas a 150 mL de solución. En todos los ensayos biológicos se emplearon grupos control. En la evaluación de los extractos acetónicos, se empleó un control negativo para evitar que la mortalidad de las larvas ocurriera a causa del solvente. Los extractos acuosos mostraron acción moderadamente baja en la mortalidad de larvas, menor del 20%. Por el contrario, la acción de los extractos acetónicos se observó a 10 y 20 mg L-1, con 15% de mortalidad, mientras que a 30 y 40 mg L-1 se registraron 22 al 38% de mortalidad, en tanto que a 50 mg L-1 la mortalidad fue del 95,4% con resultados estadísticos altamente significativos. Las concentraciones de los extractos acetónicos mostraron ser las más eficientes para el control de los mosquitos seleccionados. Ambos tipos de extractos mostraron efecto tóxico en larvas de A. aegypti ; sin embargo, se observó mayor efecto en los extractos acetónicos en relación con los extractos acuosos de E. microphyllum, lo cual constituye una alternativa viable en la búsqueda de nuevos larvicidas a partir de compuestos naturales.

In the present work the toxic activity of extracts of Eupatorium microphyllum L.F. was evaluated on 4 th instar larvae of the mosquito Aedes aegypti (Linneaus), under laboratory conditions. Aqueous extracts were utilized in concentrations of 500 mg L-1, 1,500 mg L-1 and 2,500 mg L-1 and acetone in concentrations of 10 mg L-1, 20 mg L-1, 30 mg L-1, 40 mg L-1 and 50 mg L-1. The bioassays were carried out for triplicate each one with 20 larvae, exposed for 24 hours to 150 mL of solution. In all the bioassays were employed control groups. In the evaluation of the acetone extracts, a negative control was employed to avoid that the mortality of the larvae to occur on account of the solvent. The Aqueous extracts showed low moderate action in the mortality of larvae, less than 20%. On the contrary, the action of the acetone extracts was observed to 10 and 20 mg L-1 with 15% of mortality, while to 30 and 40 mg L-1 were registered 22 to 38% of mortality. However, to 50 mg L-1 the mortality was of 95.4% with highly significant statistical results. The concentrations of the acetone extracts showed to be the most efficient for the control of the mosquitoes selected. Both types of extracts showed toxic effect in larvae of A. aegypti, nevertheless, greater effect in the acetone extracts was observed relating to the aqueous extracts of E. microphyllum, which constitutes a viable alternative in the search of new larvicides from composed natural.

Evaluación de la terapia larval en el proceso de curación de heridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa en conejos / Evaluation of the larval therapy in the healing process of infected wounds with Pseudomonas aeruginosa in rabbits

Introducción. Durante las últimas dos décadas, la terapia larval ha resurgido como una alternativa confiable y segura para la cura de úlceras cutáneas que no responden a los tratamientos convencionales. Objetivo. Evaluar el uso de las larvas de Lucilia sericata en el tratamiento de heridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa en un modelo animal. Materiales y métodos. Se tomaron 12 conejos, los cuales fueron divididos al azar en 3 grupos homogéneos: al primero se le aplicó terapia larval, el segundo se trató con terapia antibiótica y el tercero fue establecido como control. A cada uno de los animales se les realizó una herida, luego se inoculó en ésta una suspensión de P. aeruginosa y, finalmente, al registrarse el desarrollo de la infección, se procedió, en los dos primeros grupos, a los tratamientos correspondientes. Para la evaluación macroscópica de las heridas, se tuvo en cuenta la presencia de edema y exudado, mal olor, inflamación alrededor de la herida y apariencia del tejido de granulación. Al proceso de cicatrización se le hizo seguimiento a través de una técnica dermohistológica. Resultados. Se registraron claras diferencias entre el grupo de animales tratados con terapia larval vs. el grupo tratado con terapia convencional de antibióticos, estableciéndose un periodo de 10 días para alcanzar la cicatrización en el grupo de terapia larval mientras que en el segundo grupo el proceso se cumplió en 20 días. Conclusiones. S e demostró la eficacia de las larvas de L. sericata en el tratamiento de heridas infectadas con P. aeruginosa.

Introduction. During the last two decades the larval therapy has reemerged as a safe and reliable alternative for the healing of cutaneous ulcers that do not respond to the conventional treatments. Objective. To evaluate the use of the larvae of Lucilia sericata as a treatment for infected wounds with Pseudomonas aeruginosa in an animal model. Materials and methods. Twelve rabbits were randomly distributed in 3 groups: the first group was treated with larval therapy; the second was treated with antibiotics therapy and to the third no treatment was applied, therefore was established as a control group. To each animal a wound was artificially induced, and then a suspension of P. aeruginosa was inoculated into the lesion. Finally, every rabbit was evaluated until the infection development was recognized and treatment was set up for the first two groups according with the protocols mentioned above. Macroscopic evaluation of the wounds was based on the presence of edema, exudates, bad odor, inflammation around the wound and the presence of granulation tissue. The healing process was evaluated by monitoring histological changes in the dermal tissue. Results. Differences in the time required for wound healing were observed between the first group treated with larval therapy (10 days) and the second group treated with conventional antibiotics therapy (20 days). Conclusion. The L. sericata larva is and efficient tool as a therapy for infected wounds with P. aeruginosa.

Experimental infection of Leishmania L. chagasi in a cell line derived from Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae)

The present work describes the in vitro infection of a cell line Lulo, derived from Lutzomyia longipalpis embryonic tissue, by Leishmania chagasi promastigotes. This infection process is compared with a parallel one developed using the J774 cell line. The L. chagasi MH/CO/84/CI-044B strain was used for experimental infection in two cell lines. The cells were seeded on glass coverslips in 24-well plates to reach a final number of 2 x 10(5) cells/well. Parasites were added to the adhered Lulo and J774 cells in a 10:1 ratio and were incubated at 28 and 37ºC respectively. After 2, 4, 6, 8, and 10 days post-infection, the cells were extensively washed with PBS, fixed with methanol, and stained with Giemsa. The number of internalized parasites was determined by counting at least 400 cultured cells on each coverslip. The results showed continuous interaction between L. chagasi promastigotes with the cell lines. Some ultrastructural characteristics of the amastigote forms were observed using transmission electron microscopy. The highest percentage of infection in Lulo cells was registered on day 6 post-infection (29.6 percent) and on day 4 in the J774 cells (51 percent). This work shows similarities and differences in the L. chagasi experimental infection process in the two cell lines. However, Lulo cells emerge as a new model to study the life-cycle of this parasite.

Life tables and reproductive parameters of Lutzomyia spinicrassa (Diptera: Psychodidae) under laboratory conditions

Lutzomyia spinicrassa is a vector of Leishmania braziliensis in Colombia. This sand fly has a broad geographical distribution in Colombia and Venezuela and it is found mainly in coffee plantations. Baseline biological growth data of L. spinicrassa were obtained under experimental laboratory conditions. The development time from egg to adult ranged from 59 to 121 days, with 12.74 weeks in average. Based on cohorts of 100 females, horizontal life table was constructed. The following predictive parameters were obtained: net rate of reproduction (8.4 females per cohort female), generation time (12.74 weeks), intrinsic rate of population increase (0.17), and finite rate of population increment (1.18). The reproductive value for each class age of the cohort females was calculated. Vertical life tables were elaborated and mortality was described for the generation obtained of the field cohort. In addition, for two successive generations, additive variance and heritability for fecundity were estimated.

A new continuous cell line from the mosquito Psorophora confinnis (Diptera: Culicidae) and its susceptibility to infections with some arboviruses

A new cell line, PC-0199-BR, was established from embryonated eggs of the mosquito Psorophora confinnis. To date (September 2000) it has had 62 continuous passages. This is the first report of a cell line of mosquitoes belonging to the genus Psorophora. Cell growth initially was achieved in the MM/VP12 medium, supplemented with 20 percent fetal bovine serum; however, the subcultures were later adapted to Grace's medium with 10 percent fetal bovine serum. Cell morphology in the primary cultures was heterogeneous; but later in the established cell line, the predominant cell type was epithelioid. Cultured cells were predominantly diploid (2n=6); however, chromosome abnormalities were observed in a small proportion of the cells in later passages. C and G band patterns were also determined in the karyotype. The cell line isozyme profiles coincided with pupae and adult samples of the species taken from the same colony. A preliminary arbovirus susceptibility study for the cell line was undertaken. No evidence was observed of contamination of the cell line with bacteria, fungi or mycoplasma

Brain cell karyotype of the phlebotomine sand fly Lutzomyia shannoni (Dyar) (Diptera: Psychodidae)

The brain cell karyotype of New World sand fly Lutzomyia shannoni was described. This species has four pairs of chromosomes, 2N=8, with one pair of heteromorphic chromosomes

Establishment and characterization of a new continuous cell line from Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) and its susceptibility to infections with arboviruses and Leishmania chagasi

Embryonic tissue explants of the sand fly Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva 1912) the main vector of Leishmania chagasi (Cunha and Chagas), were used to obtain a continuous cell line (Lulo). The tissues were seeded in MM/VP12 medium and these were incubated at 28ºC. The first subculture was obtained 45 days after explanting and 96 passages have been made to date. Lulo is composed of epithelioid cells, showed a 0.04 generations/hour exponential growth rate and population doubling time at 24.7 h. The cell line isoenzymatic profiles were determined by using PGI, PGM, MPI and 6-PGDH systems, coinciding with patterns obtained from the same species and colony's pupae and adults. The species karyotype characteristics were recognized (2n = 8), in which pair 1 is subtelocentric and pairs 2, 3 and 4 are metacentric. Lulo was free from bacterial, fungal, mycoplasmic and viral infection. Susceptibility to five arbovirus was determined, the same as Lulo interaction with Leishmania promastigotes.

Estudio de cultivos celulares primarios de Psorophora conffinnis(Diptera: Culicidae) / Primary Psorophora confinnis (Diptera: Culicidae) cell culture studies

Con el propósito de obtener una línea celular de Psorophora confinnis (Arribalzaga, 1891) para estudios de susceptibilidad a infecciones con arbovirus, se inciaron los cultivos primarios de esta especie, vectora del virus de la encefalitis equina venezolana, tipo epidemo-epizoótico. A partir de huevos embrionados, larvas de primer estadio recién eclosionadas y ovarios de hembras adultas, se realizaron explantes por separado de tejidos embrionarios en diversos medios de cultivos, suplementados con el 20 por ciento de suero fetal bovino y una mezcla de antibióticos y antimicóticos al 1 por ciento. La esterilización del material biológico se efectuó mediante la inmersión de éste en diversas sustancias, tales como: hipoclorito de sodio al 1,6 por ciento, etanol al 70 por ciento y una solución de 0,25 por ciento de cloruro de mercurio disuelto en 70 por ciento de etanol. El crecimiento celular se inció sólo en el medio MM/VP12 en un tiempo promedio de 62 días después de efectuadas las siembras, mediante la proliferación de colonias aisladas procedentes de tejidos embrionarios, y también a partir de las terminaciones de los fragmentos larvales. La evolución del crecimiento celular hasta la formación de la monocapa confluente fue supremamente lenta y sólo se alcanzó a los 8 meses post-explante, presentando ésta una morfología celular predominantemente epitelioide. No fue exitoso el crecimiento celular a partir de los tejidos ováricos de hembras adultas. La iniciación del crecimiento celular en esta especie presentó tiempos diferentes comparados con los empleados en los cultivos celulares de otros mosquitos, lo cual indica que a pesar de utilizarse una metodología similar en el proceso para obtener cultivos primarios, las adaptaciones celulares a las condiciones físicas ambientales y nutricionales son diferentes en cada una de las especies. Este es el primer informe de cultivos celulares de una especie de mosquito perteneciente al género Psorosphora

Cultivos celulares primarios de Lutzomya shannoni (Diptera: psychodidae) y estudio cariológico preliminar de la especie / Primary cell cultures of Lutzomyia shannoni (Diptera: Psychodidae) and preliminar study karyotypes of the species

Con el propósito de obtener una línea celular de Lutzomya shannoni (Dyar) para estudios de susceptibilidad viral y mantenimiento de parásitos, se iniciaron cultivos celulares primarios de esta especie, vectora del virus de la estomatitis vesicular en los Estados Unidos y vectora sospechosa de leishmaniasis cutánea en la Américas. A partir de embriones y larvas neonatas del flebotomíneo, se realizaron explantes de tejidos embrionarios en el medio MM/VP12, suplementado con 20 por ciento de suero fetal bovino y una mezcla de antibiótico y antimicótico, los cuales fueron incubados a una temperatura promedio de 28§C, sin atmósfera de CO subíndice². El crecimiento celular comenzó en un período de 85 a 88 días después de efectuadas las siembras, mediante la presencia de vesículas compuestas de células epitelioides, flotando en le medio o adheridas a pequeños fragmentos de tejidos con células en división. Previa estimulación mecánica de los cultivos, se incrementó la proliferación celular a la semana siguiente de efectuado el procedimiento; sin embargo, el proceso mitótico de las células fue lento, similar al desarrollado con Lu. longipalpis, pero diferente a los cultivos celulares derivados de mosquitos. La formación de colonias individuales, dispersas en la superficie del frasco de cultivo, se observó a los 90 días de incubación, las cuales posteriormente evolucionaron a una monocapa semiconfluente. La morfología celular fue heterogénea con predominio de tipos epitelioides. Mediante la técnica de squash, se obtuvo el cariotipo de la especie, cuyo número diploide de cromosomas fue de 8, derivados de tejido cerebrales de larvas de IV estadio

Establishment and characterization of a cell line from the mosquito Anophles albimanus (Diptera: Culicidae)

A new cell line designated LSB-AA695BB, was established from embryos of the mosquito Anopheles albimanus. The primary culture was initiated in April, 1995, and the first passage was made 48 days later. Serial subcultures of the cells have been carried through 90 passages from April 1995 to February 1996. The cells were grown at 28ºC in MK/VP12 medium, supplement with 20 per cent fetal bovine serum; the pH tolerance ranged between 6.8 to 7.0. The cells have also been adapted to MM/Vp12 medium under the same pH, temperature and serum concentration. The majority of the cells were a fibroblast-type. Isoenzyme characterization showed a pattern similar to that of An. albimanus pupae and adults but distinct from Ae. taeniorhynchus and Ae. albopictus (C6/36) mosquito cell lines. The culture was shown to be free of mycoplasma, bacteria and fungi. Microsporidia contamination of transovarial transmission was controlled with 6.0 µg/ml of albendazole.

Estudios comparativos del ciclo de vida del mosquitos Aedes taniorhynchus (Diptera: culicidae) de dos colonias de la costa atlántica colombiana / Comparatives studies of mosquito life cycle Aedes taeniorhynchus (Diptera: culicidae) of two colonies from Atlantic Coast of Colombia

Este estudio se realizó con el propósito de establecer, en forma preliminar, en el laboratorio, si el mosquito Aedes taeniorhynchus procedente de Barranquilla y Cartagena es realmente una sola cepa y si el proceso de colonización (cría en el laboratorio) influye en el tiempo de duración de las etapas de desarrollo del ciclo de vida de este díptero. Las colonias se establecieron con mosquitos adultos, machos y hembras, recolectados en lugares cercanos a Barranquilla y Cartagena. Los insectos se identificaron taxonómicamente y se colocaron en jaulas Gerberg, en las que se introdujeron tazas con tierra húmeda para que las hembras ovipositaran. De cada localidad, se mantuvieron seis generaciones continuas a una temperatura promedio de 27§C y una humedad relativa promedio de 80 por ciento. Los estadios inmaduros se alimentaron con Ken-L molido; los adultos de los dos sexos, con solución azucarada y a las hembras se les colocó un curí para que tomaran su comida de sangre. Se registraro los tiempos de duración de cada etapa del ciclo biológico en cada una de las generaciones y se analizaron por medio de la prueba t de comparación de promedios para muestras independientes. Para los tiempos de duración de larva (t=1,51) y pupa (t=0,30) de las dos poblaciones del mosquito, no se encontraron diferencias significativas; sin embargo, para el tiempo de eclosión de la larva sí las hubo (t=4,21). Al relacionar las seis generaciones de Cartagena no se encontraron diferencias significativas para el tiempo de duración de pupa y eclosión de la larva, pero si se presentaron a partir de la cuarta generación, para el tiempo de duración de los estadios larvarios. Los resultados de este estudio preliminar sugieren que el mosquito Aedes taeniorhinchus de Barranquilla y Cartagena representa una sola especie. Se demostró, además, que su proceso de colonización, el cual invlucra la adaptación de este insecto a las condiciones específicas de un insectario, influye en la duración de su ciclo biológico

Evaluación de tres técnicas citogenéticas diferentes en los estudios morfométricos del cariotipo de Aedes taeniorhynchus (Diptera: culicidae) / Three different cytogenetic technique evaluation in the morphometrics studies of Aedes taeniorhynchus (Diptera: Culicidae) karyotype

Se efectuaron estudios morfométricos del cariotipo de Aedes taeniorhynchus, mosquito de interés médico-veterinario, por ser vector del virus de la encefalitis equina venezolana, tipo epidemo-epizoótico. En las preparaciones cromosómicas fueron utilizadas tres técnicas citogenéticas diferentes: squash, secado al aire y cultivos celulares. Estas se compararon entre sí para evaluar, en las metafase obtenidas, la longitud y morfología de los cromosomas. El número diploide de la especie fue de seis en todas la preparaciones cariológicas al utilizar cualquiera de los tres procedimientos: sin embargo, con la técnica de squash, los cromosomas mitóticos de cerebro fueron más cortos, discontinuos y con menor grado aparente de compactación de la cromatina; al utilizar la técnica de secado al aire, se obtuvieron mejores extendidos citológicos, cromosomas más separados y ligeramente de mayor longitud; en tanto que los resultados de mejor resolución, por la estructura, separación de homólogos y longitudes cromosómicas, se lograron con cultivos celulares