Neuropatogenia de HIV en la era HAART / Neuropathogenesis of HIV in the HAART era

La infección de tejidos cerebrales por HIV se asocia a desórdenes neurocognitivos identificados bajo la denominación HAND y categorizados en demencia, formas moderadas y formas asintomáticas. La introducción de terapia de alta efectividad ha implicado un notorio descenso de la demencia, pero no ha influido sobre las formas moderadas y asintomáticas que afectan alrededor del 50% de los pacientes bajo tratamiento. Esa disfunción cognitiva resulta de la pérdida de neuronas que, sin embargo, no han sido infectadas por el virus. De ahí la importancia de mecanismos indirectos en la neuropatogenia de HIV, ya que las citocinas/quimiocinas pro-inflamatorias liberadas por macrófagos/microglia infectados, la excitoxidad y el stress oxidativo se evidencian como principales causas de injuria neuronal, además de la directamente provocada por proteínas virales. Un mejor conocimiento de la interacción de HIV con su huésped humano está posibilitando el desarrollo de abordajes diganósticos más confiables y de estrategias terapéuticas más efectivas a nivel de SNC

HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND) result from brain infection. They are categorized as dementia, mild cases and asymptomatic cases. The introduction of HAART has markedly decreased dementia but no influence has been observed in mild and asymptomatic cases, since they are still identified in around 50 % of treated patients. Such cognitive dysfunction is the outcome of the loss of neurons which, however, have not been infected by the virus. hence, the importance of indirect mechanisms in HIV neuropathogenesis in which cytokines/chemokines released by infected macrophages/microglia, excitotoxic neuronal injury and oxidative stress are relevant causes of neurodegeneration besides that exerted by viral proteins. A better understanding of the HIV interaction with th human host is enabling the development of more reliable diagnostic biomarkers and more effective therapeutic strategies at CNS level

Regional differences in astrocyte activation in HIV-associated dementia

Since astrogliosis is a histological marker usually observed in HIV-associated dementia (HIV-D),we decided to investigate the potential relationship between the expression of glial fibrillary acidicprotein (GFAP) and the regional distribution of cells positive (+) for this specific marker of astrocyte activation.Histological sections of brain tissues obtained at necropsy from 5 HIV-D patients and 5 age-matched controlswithout history of neuropsychiatric illness were immunostained with peroxidase. Mean numbers of GFAP(+)astrocytes were significantly increased in entorhinal cortex, hippocampus and subcortical white matter of patients,but values in frontal cortex and basal ganglia were similar to those of controls. In contrast, surface density ofimmunoreactive GFAP was significantly increased in all tested brain areas from all patients, including unusuallyaffected regions such as entorhinal cortex and hippocampus. Therefore, such consistent finding of hypertrophicastrocytes, ranging from highest cell percentajes in subcortical white matter to lowest in basal ganglia indicatesthat quantification of surface density in GFAP (+) cells appears to be a more reliable approach to score gliosisthan the counting of their cell nuclei. Because astrocyte activation involves both protective and detrimental effectson adjacent neuronal subsets, the evidence of regional differences in this reactive potential highlights theimportance of accurately defining their contribution to the neuropathogenesis not only of HIV-D, but of a widerange of neurodegenerative disorders.

Diferencias regionales en la activación astrocitaria en demencia asociada a HIV. Siendo laastrogliosis un signo histológico habitualmente presente en demencia asociada a HIV, se investigóla eventual relación entre expresión de proteína gliofibrilar ácida (GFAP) y localización regional de células positivaspara ese marcador específico de la activación astrocitaria. Por inmunoperoxidasa, se procesaron cortes histológicosde tejidos cerebrales obtenidos por necropsia de 5 pacientes y 5 controles de edades similares pero sin antecedentesneuropsiquiátricos. Según los valores de las medias registrados por conteo de astrocitos GFAP(+) en pacientes,el número fue significativamente mayor en corteza entorrinal, hipocampo y sustancia blanca subcortical, mientrasque en corteza frontal y ganglios basales no se encontraron diferencias con controles. En cambio, la densidad desuperficie del material GFAP inmunorreactivo en pacientes estuvo significativamente aumentada en todas las áreascerebrales analizadas, incluso en regiones inusualmente afectadas, como corteza entorrinal e hipocampo. Entreesos astrocitos hipertróficos, el mayor porcentaje correspondió a sustancia blanca subcortical, y el menor a gangliosbasales. Cabe concluir que el constante hallazgo de agrandamiento astrocitario señala a la medida de la superficieinmuno-reactiva como mejor índice de activación celular que el conteo de núcleos de las células marcadas. Dadoslos reconocidos efectos de la astrogliosis sobre las subpoblaciones neuronales vecinas, la comprobadaregionalización de ese potencial reactivo destaca el interés de precisar su contribución en la neuropatogenia, tantode demencia asociada a HIV como de otras enfermedades neurodegenerativas.

A quantitative approach to correlate astrocyte differentiation and phagocytic activity

A triple staining procedure (PAP labeling for GFAP, PAS reaction for added yeast cells and hematoxylin for nuclear staining of the whole cell monolayer) had disclosed that Junin virus infection enhanced phagocytic activity by inducing greater astrocyte differentiation. Here, we resorted to a mathematical approach for simultaneous evaluation of astrocyte differentiation and potential phagocytosis. At light microscopy level, the total number of: a) PAS-stained yeast cells, b) PAS-stained yeast cells associated to GFAP-positive astrocytes, c) GFAP-positive astrocytes, and d) total number of GFAP-labeled and non-labeled astrocytes, were counted within the monolayer area delimited by a grid with a total area of 0.01 mm2. As the percentage of PAS-stained yeast cells associated to GFAP-positive astrocytes correlated significantly with the percentage of GFAP-positive astrocytes for the three yeast cell incubation times (24, 48 and 72 h), a mathematical approach involving a so-called beta parameter representing the percentage of differentiated astrocytes capable of taking up 50 of added yeast cells, was developed. Since beta value dropped along yeast cell incubation time, and more markedly in Junin-virus infected samples, a numerical value was thus available to assess enhanced phagocytic activity in astrocytes undergoing differentiation. Therefore, the application of a mathematical approach to cell monolayers subjected to current staining techniques, allows more objective analysis of data provided by cursory visualization at light microscopy level.

Immunocytochemical and morphological effects of short-term stimulation of cultured astrocytes

Both image analysis at light microscopy level and ultrastructural characterization by transmission electron microscopy were employed to evaluate the differentiation stage in young cultured mouse astrocytes after 1-day exposure to dBcAMP, a chemical compound known to induce cell activation. The aim was to validate an experimental model of stimuled astrocytes preserving the properties of recently seeded cells, thus avoiding the overlapping effects of in vitro aging. Differentiated astrocytes, as evidenced by GFAP labeling by streptavidin-perioxidase, doubled their number in treated cultures (45 per cent) versus controls (23 per cent). In addition, a significant increase in processing-bearing astrocytes (elongated forms) to the detriment of immature polygonal astrocytes, was recorded. No noticeable changes were found in cell perimeter, but cell area displayed a significant reduction in labeled surface of astrocytes undergoing morphological differentiation. Concomitantly, electron microscopy showed that radially organized bundles of numerous intermediate filaments compatible with GFAP replaced the few scattered structures observed in control cultures. However methodological caution is advisable as regards the relevance of the in vitro counterpart in situ reactive astrocytes, since cell plasicity is recognized to depend on culture conditions. At any rate, present quantitative results demonstrate that GFAP-positive cell percentage and cell area measurement are adequate parameters of early immunocytochemical and morphological differentiation, respectively, and thus contribute to a better histometric characterization of an easily available substrate to discriminate the wide variety of factors involved in CNS response to injury.

Cell differentiation increases astrocyte phagocytic activity: a quantitative analysis of both GFAP labeling and pas-stained yeast cells

Since efficiency of phagocytic potential in activated astrocytes is still a subject of controversy, an attempt was made to quantify simultaneously phagocytic activity and astrocyte differentiation. Resorting to Junin virus, known to induce astrocyte activation, infected vs control samples of cultured rat astroglial cells were serially harvested up to day 12 post-inoculation (pi), and subjected to a triple staining procedure consisting in immunoperoxidase labeling of GFAP, periodic acid-Schiff (PAS) reaction in added baker's yeast cells and hematoxylin for nuclear staining of the whole cell monolayer. Adopting GFAP labeling as a specific marker of astrocyte differentiation, the immunoprecipitate development over time was measured. Direct calculation of the initial reaction rate was feasible given its linear behavior during the first 10 min, so that GFAP amount was regarded proportional to peroxidase activity. As determined by digital image analysis, mean optical density (MOD) values of GFAP in infected samples increased from 0.618 + 0.082 at day 1 pi to 0.825 + 0.125 at day 3, leveling off at 1.010 + 0.101 as from day 9, while control unifected samples remained unchanged at roughly 0.6 during the entire observation period. In turn, phagocytosis was quantified by PAS staing densitometry, whose intensity varied according to wall degradation of yeast cells. MOD levels of PAS-stained phagocytized yeast cells were significantly lower (p <0.05) in efected vs control cultures at 48 and 72 h following their addition to the astroglial monolayer. According to simultaneous quantification of two components of astrocyte response to viral infection, it is concluded that phagocytic activity increases with astrocyte differentiation.

Age-dependent morphological changes in dBcAMP-treated astrocytes

Since changes in cell morphology are conspicuous features of astrocyte reaction, we resorted to an histometric approach to evaluate age influence on such morphological response to activating stimuli. To this end, first subculture of rat brain astrocytes at 1, 9 or 21 days in vitro (DIV) were treated during 2 hs with l mM of dBcAMP, a chemical compound known to induce cell differentiation. Following treatment, immunoperoxidase labeling of GFAP, specific marker of astrocyte activation, was carried out. Although total count of GFAP-positive cell foci was greater in treated samples in all times tested, when such cell foci were evaluated by image analysis, differences between perimeter/area ratios of such foci were only statistifically significant at l DIV. It may be concluded that while dBcAMP effect is maintained despite astrocyte aging, the morphological pattern of response varies markedly along the observation period.

A brain soluble fraction inhibits synaptosomal membrane but not astrocyte ATPase activity

Since a brain soluble fraction (peak II) is known to be able to inhibit synaptosomal membrane Na+, K+-ATPase activity, here we attempted to compare its effect on cellular and subcellular brain components such as synaptosomal and astrocytic membranes, as well as mitochondrial preparations. Peak II highly inhibited total ATPase in synaptosomal membranes but failed to modify enzyme activity in astrocytic and mitochondrial preparations. Findings suggest cellular and subcellular specificity of peak II on brain ATPase activity.

Neural spread of Junin virus in intraperitoneally inoculated rats

Una vez establecida la ruta neural como la seguida por el virus Junín (VJ) a partir de su inoculación intradérmica en ratas lactantes, resultaba de interes determinar cuál era la vía adoptada luego de inoculado intraperitonealmente. Desde la 2da semana se evidenció una enfermedad neurológica que a los 30 días post-infección alcanzó un 84 por ciento de mortalidad. En curso de ese período, se efectuaron cosechas de tejidos extraneurales y neurales para la marcación por inmunoperoxidasa del antígenos viral y el examen histopatológico, asi como la titulación de infectividad que también se extendió a sangre. En todas las muestras de tejido en que se detectó virus infectivo, sea por cocultivo o por aislamiento convencional, se logró la marcación del antígeno viral. El VJ estuvo presente en valores mínimos en bazo e hígado desde el día 2 al 5, y en sangre del 5 al 15. En tejidos neurales, el antígeno viral fue inicialmente revelado al día 5, tanto en ganglios raquídeos torácicos como en los segmentos medulares relacionados. A partir del día 7, la positividad se extendió a la médula espinal en toda su extensión; a la vez, ya había evidencias de presencia viral en tronco cerebral, con disfusión al resto de estructuras encefálicas desde el día 10. Pese a la presencia masiva del antígeno viral en neuromas, dichas células no mostraban cambios morfológicos aparentes. Dado que la infección de ganglios raquídeos y de médula espinal invariablemente precedió al acesso viral a encéfalo, y ello ocurrió en forma concomitante a la desaparición del virus en órganos linfo-reticulares y en sangre, la vía neural parece ser la adoptada por el VJ desde cavidad peritoneal hasta sistema nervioso central

Ultrastructural study of cell injury induced by coxsackievirus B3 in pancreatic and cardiac tissues

Con fines de una mejor caracterización de la injuria celular provocada por el coxsackievirus B3 en páncreas y corazón, ratones Balb/C ya destetados fueron intraperitonealmente inoculados con una variante miocardítica de ese serotipo viral. A nivel ultraestructural, las células pancráticas acinosas mostraron evidente distorsión, evidenciada por acentuada pérdida de organelas y de gránulos de zimógeno, así como apreciable dilatación del retículo endoplásmico granuloso. En cuanto a las células cardíacas, las alteraciones citoesqueléticas fueron severas, llegando a incluir colapso de miofibrilas con disminuición de su número e irregularidad en su disposición. Además, los cardiomiocitos exhibieron cromatina de distribución irregular y mitocondrias de tamaño agranado. A la vez de los focos necróticos tendían a desaparecer, el número de fibroblastos aumentaba en forma coincidente a la progresiva cicatrización de la lesión. Los cambios ultraestructurales observados en páncreas y corazón fueron concomitantes en consecuencia que el daño celular era atribuíble a la acción directa del virus

Morphological characterization of brain cell cultures by controlled silver impregnation

Dada la heterogeneidad del tejido nervioso, el uso de cultivos neurales como modelo de estudios neurobiológicos exige una caracterización precisa, tanto de los tipos celulares presentes en las monocapas como de su grado de diferenciación. Si bien la microscopía de contraste de fase ha sido el recurso más empleado en el análisis morfológico de los cultivos neurales, es reconocida la superioridad de la tinción con plata. Con el objeto de lograr una más fina caracterización celular, recurrimos a una técnica que habíamos desarrollado años atrás para la impregnación argéntica de fibras colágenas y reticulares. El procedimiento debió adecuarse a su aplicación a neuronas y astrocitos cultivados y, por tanto, inmaduros o en vías de maduración. Los pasos fundamentales consistieron en el uso de dicromato de potasio como mordiente, en forma previa a la impregnación argéntica, la que era seguida por reducción en solución formólica de gelatina, que actuaba como coloide protector. Los lavados posteriores se realizaron con etanol 95- cuando se pretendía destacar neuronas, o con agua piridinada cuando se trataba de astrocitos. En cultivos derivados de encéfalo de embrión de ratón, la plata precisó los variados tipos neuronales y su grado de maduración morfológica. Asimismo, en cultivos obtenidos de cerebro de ratón recien nacido, se logró caracterizar las sucesivas etapas de diferenciación astrocitaria. En neuronas y astrocitos madurados, la identificación fue confirmada por marcación (método PAP) de enolasa específica de neurona y proteína gliofibrilar ácida, respectivamente. La técnica propuesta, que puede definirse como impregnanción argéntica controlada, parece ser indicada para la caracterización morfológica de células neurales en cultivo, particularmente antes de la expresión de los marcadores específicos en toda la extensión de la monocapa

Experimental study of the fibroblastic reaction induced by carbon fiber

En años recientes, ha sido propuesto el uso de fibras de carbono en cirugía reparadora de tendones y ligamentos, ya que dichas fibras incitaban una intensa reacción del tejido conjuntivo, con sustitución de las estructuras lesionadas y recuperación de la función afectada. El objeto del trabajo fue el análisis histológico de esa reacción fibroblástica bajo las siguientes condiciones experimentales: a) sistema in vivo: reemplazo quirúrgico total del tendón de Aquiles de ratas adultas por un grueso haz de fibras de carbono operando como tutor, y estudio histológico de la zona operada; b) sistema in vitro: en tubos Leighton, siembra de fibroblastos de embrión de rata acompañados de pequeños segmentos de fibras de carbono, con cosecha a los 1, 2 y 6 días de incubación a 37-C y examen ulterior por microscopías ópticas y electrónica de barrido. El estudio histológico de la zona operada a los 30 días de la intervención, mostró franca reacción tisular, caracterizada por aparición de células gigantes multinucleadas fagocitando pequeños restos de fibras de carbono, acompañadas de gran proliferación de capilares sanguíneos, fibroblastos y fibras colágenas. La reacción fue mucho más acentuada a los 90 y 120 días de la cirugía, observándose que amplios sectores antes ocupados por fibras de carbono habían sido reemplazados por masas de tejido conjuntivo fibroso. En cultivos celulares, la microscopía óptica mostró que los fibroblastos multiplicaban adhiréndose a las fibras de carbono. En muestras análogas, la microscopía electrónica de barrido precisó las características de...