Anticuerpos anti-FVIII: su evaluación por citometría de flujo / Anti FVIII antibodies: evaluation by flow cytometry

En este trabajo se describe un sistema para evaluar y caracterizar los anticuerpos anti-FVIII en pacientes con Hemofilia A Severa (HAS) que reciben el Factor como tratamiento de sustitución. Consiste en el empleo combinado de microesferas y Citometria de Flujo (CF). El rFVIII fue acoplado a microesferas de 2 µm de diámetro (m-FVIII) las cuales se incubaron con diluciones de plasma o suero de pacientes con (n=13) o sin (n=17) inhibidor, pacientes en Tratamiento Inmunotolerante (TIT)(n=5) y dadores normales (N) (n=12). Los anticuerpos se revelaron con anti-lgG humana, anti-lgG1, anti-lgG2, anti-IgG3 o anti-lgG4 biotiniladas, seguido por streptavidina-ficoeritrina. Se registraron los valores de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM). Microesferas sin FVIII (m-Control) se utilizaron como control. El resultado se expresó como índice: (IFM de m-FVIII/IFM de m-Control) multiplicado por la inversa de la dilución de máxima respuesta. Se determinó el porcentaje de contribución de cada subclase de IgG. Los resultados presentaron un 86 por ciento de concordancia con la prueba de Bethesda y un 80 por ciento con ELISA. El método fue útil para el seguimiento de los pacientes durante el TIT. La IgG4 prevaleció en pacientes con alto título y al comienzo del TIT. La CF es fácil y rápida y requiere sólo 200 µl de muestra.

In this study, a Flow Cytometry (FC) system is described for detecting and characterizing antibodies (inhibitors) to Factor VIII (FVIII) in Severe Haemophilia A (SHA) patients following FVIII infusion. A combination of microspheres and Flow Cytometry (FC) was employed. First, rFVIII was coupled to microspheres of 2 µm of diameter (m-FVIII). Then, they were reacted with dilutions of plasma or serum of patients with (n=13) or without (n=17) inhibitors. Five patients receiving Immunotolerant Treatment (ITI) and 12 normal donors were included. Microspheres without rFVIII were used as control (m-Control). Captured anti-FVIII antibodies were detected using biotinylated anti-Human IgG, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 followed by streptavidin-phycoerythrin. FC analysis was performed recording Mean Fluorescence Intensity (MFI). Results were given as an Index: the highest MFI ratio between m-FVIII and m-Control multiplied by the inverse of the corresponding plasma dilution. The contribution of each IgG subclass was expressed as percentage. FC results had 86 per cent and 80 per cent of coincidence with the Bethesda method and ELISA respectively. The test was useful to measure anti-FVIII antibodies during the ITI. IgG4 was the prevalent IgG subclass in patients with high level of inhibitors and previously to ITI. FC was easy, fast and requires only 200 µl of sample.

Humoral antibody response in mice infected with Trypanosoma cruzi

Ratones Swiss y BALB/c inoculados con 50 formas sanguíneas de Trypanosoma cruzi, cepa Tulahuén, fueron utilizados para estudiar la susceptibilidad a la infección y la cinética de la respuesta inmune humoral. De acuerdo a los datos de mortalidad, los ratones BALB/c fueron altamente susceptibles y los ratones Swiss fueron resistentes a la infección. Los anticuerpos dirigidos contra el parásito se detectaron por el método de inmunofluorescencia indirecta (Ab-IIF) mientras que aquellos involucrados en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) se evaluaron utilizando como célula efectora esplenocitos de ratón normal (Ab-ADCC). Aunque todos los animales desarrollan Ab-IIF in Ab-ADCC, en los ratones Swiss se detectaron antes, y los títulos de Ab-ADCC fueron mayores que en los ratones BALB/c. Los esplenocitos de ratones Swiss normal tienen mayor capacidad para mediar ADCC in vitro que los de BALB/c. Estos resultados indican una correlación directa entre la respuesta inmune humoral y la resistencia al Trypanosoma cruzi en los ratones experimentalmente infectados

Isolation by Percoll gradient centrifugation and radiolabeling of bloodstream forms of Trypanosoma cruzi

Se diseñó un método para purificar las formas sanguíneas de T. cruzi utilizando un gradiente de Percoll contínuo de 6 cm de longitud (Percoll 60% en "HSA-buffer", preformado por centrifugación a 20.000 g durante 90 min a 4-C en un rotor Sorvall SS 34). El mismo se sembró con 6 x 10**7 elementos (parásitos semipurificados de glóbulos rojos por centrifugación diferencial a partir de sangre desfibrinada) y se centrifugó a 800 g, 15 min. Los parásitos se ubicaron en 1,063 a 1,064 g/ml, existiendo una buena resolución entre ellos y los elementos figurados de la sangre. Los parásitos purificados incorporaron H-uridina y dieron valores del 23% precipitables por TCA. La viabilidad de los mismos fue totalmente preservada según lo evidenciado en los ensayos de infectividad "in vivo"

Citotoxicidad inducida por el suero de pacientes con SIDA y alto riesgo de SIDA (SAR) contra células infectadas por el virus de Epstein-Barr / Cytotoxicity induced by serum of patients with AIDS and high risk of AIDS against infected cells by Epstein-Barr virus

En el suero de pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y sujetos de alto riesgo de SIDA (SAR), se estudió la relación entre la actividad de anticuerpos anti-VCA, la presencia de complejos inmunes circulantes (CIC) y la capacidad de inducir la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (CDA) de linfocitos normales contra líneas celulares infectadas con EBV. Se observó que los sueros de estos pacientes indujeron la CDA de linfocitos mononucleares (LM) normales contra células linfoblastoideas infectadas con EBV (P3HRIK y Raji). El título de anti-VCA en los pacientes con SIDA y SAR no difirió del grupo control normal. El contenido de IgG sérica y el nivel de CIC precipitable con PEG-PEG-pp) fue superior al normal. No se encontró relación entre PEG-pp y el nivel de CIC determinado por fijación de C1q (C1q-F). La CDA está favorecida por la presencia de CIC que actúan como puente entre receptores Fc (RFc) de las células P3HRIK y Raji y los LM efectores. De esta manera factores presentes en el suero de pacientes con SIDA y SAR pueden cooperar con LM normales no sensibilizados en la destrucción de células infectadas por EBV a través de la CDA clásica y la CDA mediada por los puentes RFc-RFc