ABSTRACT
Se obtuvieron hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales (AcM) contra el IFN alfa-2 humano recombinante (rh*IFN) mediante la hibridación de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados y el mieloma P3/x63.Ag8.653. En el tamizaje de las células secretoras de anticuerpos específicos se emplearon sistemas microELISA, con el antígeno unido directamente a la fase sólida, o mediante otro AcM anti rh*IFN. Se seleccionaron nueve clones de hibridomas específicos para rh*IFN, de los cuales se escogió el secretor de AcM denominado CB-IFNA2.4 para los experimentos de desarrollo de un sistema ELISA tipo sandwich. Empleando el AcM CB-IFNA2.3 como anticuerpo de captura y el CB-IFNA2.4 conjugado con peroxidasa, se construyó un sistema ELISA sandwich capaz de detectar 1 ng de antígeno por milimetro. Se realizó un estudio de optimización de los diferentes pasos del ELISA y del reconocimiento del antígeno, cuando este es sometido a distintos tratamientos desnaturalizantes. Este sistema se ha empleado exitosamente en el seguimiento del proceso de producción y purificación del rh*IFN. En experimentos preliminares con ratas inoculadas con esta molecula, se denostró que este ELISA puede detectar su presencia en suero
Subject(s)
Mice , Antibodies, Monoclonal/isolation & purification , Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , Hybridomas , Interferon-alpha/analysisABSTRACT
Utilizando anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón para el factor de cecimiento epidérmico (EGF), hemos construído un radioinmunoensayo de fase sólida (RIA-FS) y dos sistemas ELISA tipo sandwich, para la cuantificación de esta molécula. El RIA-FS está basado en la adsorción del AcM CB-EGF.1 (IgG1) al poliestireno, a 20 *g/ml, y la incubación de las muestras a estudiar con el EGF radioyodado, por 3 horas, a 37-C. La sensibilidad del ensayo es de 2 ng/ml, con coeficientes de variación intra e inter ensayo por debajo de 12 %, para un amplio rango de concentraciones (límite superior de 300 ng/ml). En los ELISA se empleó este mismo AcM, conjugado con peroxidasa, como anticuerpo de revelado, y el CB-EGF.2 (IgG1) en la fase sólida. Si el antígeno y el conjugado se incuban secuencialmente, la sensibilidad del sistema es de 6 ng/ml, pero si ambos son mezclados y aplicados simultáneamente a la fase sólida activa, la sensibilidad del ensayo se incrementa hasta 400 pg/ml. El ELISA "secuencial" demostró una excelente correlación con el RIA-FS para la cuantificación de EGF humano recombinante, en muestras provenientes del proceso de producción y purificación de esta molécula. Ambos sistemas ELISA han sido ensayados en pruebas preliminares para su capacidad de detección de EGF humano en muestras de saliva y orina, arrojando valores que coinciden con datos reportados previamente en la literatura
Subject(s)
Mice , Antibodies, Monoclonal , Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , Epidermal Growth Factor , RadioimmunoassayABSTRACT
La utilidad potencial del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFh) como medicamento para la cicatrización de heridas, posible agente antitumoral y para otras aplicaciones, ha conducido a que su estudio, producción y aplicación se hayan incrementado notablemente en los últimos años. Nosotros generamos ocho hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales (AcM) contra el EGFh, e igualmente desarrollamos un radioinmunoensayo en fase sólida (RIA-FS) y un enzima-inmunoensayo (ELISA) para la cuantificación del EGFh en muestras de diverso origen, empleando en estos, dos de los AcM obtenidos (CB-EGF.1 y CB-EGF.2). La sensibilidad de estos ensayos fue de 2 ng/ml y 6 ng/ml, respectivamente. En este trabajo, además, se presentan resultados acerca del reconocimiento del EGF de ratón por dichos AcM, así como la obtención de fragmentos F(ab)'2 activos a partir de uno de ellos