Adherence of enteroaggregative Escherichia coli to the ileal and colonic mucosa: an in vitro study utilizing the scanning electron microscopy / Aderência da Escherichia coli enteroagregativa a mucosas ileal e colônica: estudo in vitro utilizando microscopia eletrônica de varredura

CONTEXT: Enteroaggregative Escherichia coli strains have been associated with persistent diarrhea in several developing countries. In vivo procedures with animal models, in vitro assays with cellular lines and in vitro organ culture with intestinal fragments have been utilized to study these bacteria and their pathogenicity. OBJECTIVE: The present experimental research assessed the pathogenic interactions of three enteroaggregative Escherichia coli strains, using the in vitro organ culture, in order to show the adherence to different regions of both, the ileal and the colonic mucosa and demonstrate possible mechanisms that could have the participation in the prolongation of diarrheiogenic process. METHODS: This study used intestinal fragments from terminal ileum and colon that were excised from pediatric patients undergoing intestinal surgeries and from adult patients that underwent to colonoscopic procedures. Each strain was tested with three intestinal fragments for each region. Tissue was fixed for scanning electron microscopic analysis. RESULTS: These bacteria colonized ileal and colonic mucosa in the typical stacked-brick configuration in the ileum and colon. In both regions, the strains were seen over a great amount of mucus and sometimes over the intact epithelium. In some regions, there is a probable evidence of effacement of the microvilli. It was possible to see adhered to the intestinal surface, bacteria fimbrial structures that could be responsible for the adherence process. CONCLUSION: In order to cause diarrhea, enteroaggregative Escherichia coli strains adhere to the intestinal mucosa, create a mucoid biofilm on the small bowel surface that could justify the digestive-absorptive abnormalities and consequently, prolonging the diarrhea.

CONTEXTO: Cepas de Escherichia coli enteroagregativa têm sido associadas à diarreia persistente em vários países em desenvolvimento. Procedimentos in vivo com modelos animais, cultura de órgão in vitro com fragmentos intestinais e ensaios in vitro com linhas celulares têm sido utilizados para estudar essas bactérias e a sua patogenicidade. OBJETIVO: A presente investigação experimental avaliou as interações patogênicas de três cepas de Escherichia coli enteroagregativa, usando cultura de órgão in vitro, para mostrar a aderência a diferentes regiões do intestino: íleo e cólons e demonstrar possíveis mecanismos que poderiam ter participação na perpetuação do processo diarréico. MÉTODOS: Este estudo usou fragmentos de íleo terminal e cólon que foram retirados de pacientes pediátricos submetidos a cirurgias intestinais e de pacientes adultos que foram submetidos a colonoscopias. Cada cepa foi testada com três fragmentos intestinais para cada região. O tecido foi fixado para análise sob microscopia eletrônica de varredura. RESULTADOS: Estas bactérias colonizaram mucosa ileal e colônica na configuração típica de pilhas de tijolos. Em ambas as regiões, as bactérias foram vistas sobre grande quantidade de muco e, às vezes, sobre o epitélio intacto. Em algumas áreas, há evidência de provável achatamento de vilosidades. Foi possível ver sobre a superfície intestinal, estruturas fimbriais bacterianas que poderiam estar relacionadas ao processo de adesão. CONCLUSÕES: Para causar diarreia, cepas de Escherichia coli enteroagregativa aderem à mucosa intestinal e criam um biofilme de muco sobre a superfície do intestino delgado, o que poderia justificar as anormalidades digestivo-absortivas e, por conseguinte, prolongar a diarreia.

Pathophysiology of enteroaggregative Escherichia coli infection: an experimental model utilizing transmission electron microscopy / Fisiopatologia da infecção pela Escherichia coli enteroagregativa: um modelo experimental utilizando microscopia eletrônica de transmissão

CONTEXT: Enteroaggregative Escherichia coli strains have been associated with persistent diarrhea in several developing countries. In vivo procedures with animal models as rat, rabbit and gnotobiotic piglets intestinal loops, in vitro assays with cellular lines like T84, Caco 2, HT29, HeLa e HEp-2 and in vitro organ culture with intestinal fragments have been applied to study these bacteria and their pathogenicity. OBJECTIVES: The present experimental research assessed the pathogenic interactions of three enteroaggregative Escherichia coli strains, using the in vitro organ culture, in order to observe and compare alterations in different regions of both, the ileal and the colonic mucosa. METHODS: This study applied intestinal fragments from terminal ileum and colon that were excised from pediatric and adult patients that underwent colonoscopic procedures. Tissue was fixed for transmission electron microscopic study. Each bacterium was tested with three intestinal fragments for each region. RESULTS: Enteroaggregative Escherichia coli strains colonized and provoked citotoxic effects in the ileal and colonic mucosa. Total or partial villi destruction, vacuolization of basal cytoplasm of the enterocytes, epithelium detachment, derangement of the structure and epithelial cell extrusion in ileal mucosa could explain the perpetuation of the diarrhea. Bacterial aggregates were seen in intestinal lumen associated with mucus and cellular debris and in the intercellular spaces of the destroyed epithelium, suggesting bacterial invasion that seemed to be secondary to the destruction of the tissue. CONCLUSIONS: Pathogenesis of persistent diarrhea should include alterations in the small bowel structures where the digestive-absorptive functions take place. In the colonic mucosa the inflammatory lesions could explain the occurrence of colitis.

CONTEXTO: A Escherichia coli enteroagregativa está associada à diarréia persistente em vários países em desenvolvimento. Procedimentos in vivo empregando modelos animais como ratos, coelhos e alças intestinais de suínos gnotobióticos, e modelos in vitro com linhas celulares, tais como: T84, Caco 2, HT29, HeLa e HEp-2 e cultura de órgão in vitro são empregados no estudo desta bactéria e de sua patogenicidade. OBJETIVOS: Neste trabalho foram avaliadas as interações de três cepas de Escherichia coli enteroagregativa usando cultura de órgão in vitro, com o objetivo de observar e comparar as alterações em diferentes regiões do intestino: mucosa ileal e mucosa colônica. MÉTODOS: Este estudo empregou fragmentos de íleo terminal e cólon extraídos de pacientes submetidos a colonoscopia. Os fragmentos intestinais infectados in vitro foram fixados para avaliação em microscopia eletrônica de transmissão. Cada cepa bacteriana foi testada com três fragmentos intestinais de cada região. RESULTADOS: As cepas estudadas colonizaram e provocaram efeitos citotóxicos no íleo e no cólon. Alterações na mucosa ileal, tais como: destruição parcial ou total das vilosidades, vacuolização do citoplasma basal dos enterócitos, destacamento do epitélio e desarranjo da estrutura com extrusão de células epiteliais poderiam explicar a perpetuação do processo diarréico. Agregados bacterianos foram vistos no lúmen intestinal associados a muco e restos celulares e nos espaços intercelulares do epitélio destruído sugerindo invasão bacteriana que pareceu ser secundária à destruição do tecido. CONCLUSÃO: A patogênese da diarréia persistente deve incluir alterações no intestino delgado aonde ocorrem as funções digestivo-absortivas. Na mucosa colônica as lesões inflamatórias observadas justificariam a ocorrência de colite.

Avaliação microscópica e ultra-estrutural do endotélio de veia safena preparada pela técnica "no touch" / Microscopic and ultrastructural evaluation of the saphenous vein endothelium for CABG prepared by the no touch technique

OBJETIVO: O enxerto de veia safena (VS) utilizado em revascularização miocárdica possui uma vida útil, sendo o estágio final a oclusão do vaso. Esforços em adquirir novas técnicas de coleta da VS podem possibilitar uma viabilidade maior do enxerto. MÉTODOS: Vinte pacientes foram randomizados e divididos em dois grupos com o objetivo de avaliação do endotélio vascular. A técnica "no touch" (NT) consiste em retirar o segmento de VS com o tecido perivascular. A técnica convencional consiste em retirar a VS, com remoção "in situ" do tecido perivascular e conseqüente vasoespasmo. Houve um padrão de retirada das VS com incisões longitudinais escalonadas. Características da VS foram consideradas. A avaliação do endotélio das VS foi realizada usando microscópio eletrônico (ME) pelo método de varredura e de transmissão. Cortes histológicos das VS foram corados em Hematoxilina-Eosina (HE). O colágeno subendotelial foi analisado pelos métodos de Picro-Sirius e Tricrômio de Masson. RESULTADOS: A ME evidenciou que o Grupo NT possui maiores áreas endoteliais não desnudadas, além de um menor número de células degradadas. A coloração em HE nos permitiu verificar a forma e a integridade das camadas das VS. Há um predomínio maior de fibras colágenas coradas no Grupo NT. CONCLUSÕES: A técnica NT permite uma melhor preservação endotelial da VS, sugerindo um enxerto mais viável em longo prazo.

OBJECTIVE: Saphenous vein grafts (SV) used in coronary artery bypass grafting have a limited life and vein occlusion may be the final adverse effect. Efforts to develop new techniques to harvest the saphenous vein may improve the viability of the graft. METHODS: Twenty patients were randomly divided into two groups with the objective of evaluating the vascular endothelium. The No Touch (NT) technique consists in removing the saphenous vein with perivascular tissue. The conventional technique consists in harvesting with "in situ" removal of the perivascular tissue. The standard saphenous vein harvesting procedure used bridged incisions. Characteristics of the vein were considered. Evaluation of the endothelium was achieved by electron microscopy and histologic analysis using hematoxylin eosin staining. The Picrosirius and Masson Trichrome methods were used to analyze subendothelial collagen. RESULTS: Electron microscopy demonstrated that the NT Group had larger non-denudated endothelial areas as well as a smaller number of degraded cells. Histological analysis showed the form and integrity of the saphenous vein layers. A larger amount of collagen fibers were identified in the NT Group. CONCLUSIONS: The NT technique better preserves the saphenous vein endothelium suggesting a more viable graft in the long term.

Active transcription and ultrastructural changes during Trypanosoma cruzi metacyclogenesis

The differentiation of proliferating epimastigote forms of Trypanosoma cruzi , the protozoan parasite that causes Chagas’ disease, into the infective and non-proliferating metacyclic forms can be reproduced in the laboratory by incubating the cells in a chemically-defined medium that mimics the urine of the insect vector. Epimastigotes have a spherical nucleus, a flagellum protruding from the middle of the protozoan cell, and a disk-shaped kinetoplast - an organelle that corresponds to the mitochondrial DNA. Metacyclic trypomastigotes have an elongated shape with the flagellum protruding from the posterior portion of the cell and associated with a spherical kinetoplast. Here we describe the morphological events of this transformation and characterize a novel intermediate stage by three-dimensional reconstruction of electron microscope serial sections. This new intermediate stage is characterized by a kinetoplast compressing an already elongated nucleus, indicating that metacyclogenesis involves active movements of the flagellar structure relative to the cell body. As transcription occurs more intensely in proliferating epimastigotes than in metacyclics, we also examined the presence of RNA polymerase II and measured transcriptional activity during the differentiation process. Both the presence of the enzyme and transcriptional activity remain unchanged during all steps of metacyclogenesis. RNA polymerase II levels and transcriptional activity only decrease after metacyclics are formed. We suggest that transcription is required during the epimastigote-to-metacyclic trypomastigote differentiation process, until the kinetoplast and flagellum reach the posterior position of the parasites in the infective form.

A diferenciação de formas epimastigotas (proliferativas) do Trypanosoma cruzi, parasita protozoário causador da doença de Chagas, em formas metacíclicas tripomastigotas (infectivas e não proliferativas), pode ser reproduzida em laboratório incubando-se as células em um meio quimicamente definido que imita a urina do inseto vetor deste parasita. Os epimastigotas têm um núcleo esférico, o flagelo se projeta da metade do corpo do protozoário e o cinetoplasto (organela que possui o DNA mitocondrial) possui formato de disco. Os tripomastigotas metacíclicos têm um núcleo alongado com o flagelo emergindo da extremidade posterior da célula associado ao cinetoplasto esférico. Neste trabalho descrevemos as mudanças morfológicas que ocorrem durante essa transformação e caracterizamos uma nova forma intermediária do parasita usando reconstrução tridimensional de cortes seriados, visualizados por microscopia eletrônica de transmissão. Essa nova forma intermediária é caracterizada pela compressão do cinetoplasto contra o núcleo alongado, indicando que a metaciclogênese envolve movimentos ativos do cinetoplasto associado à estrutura flagelar em relação ao corpo celular. Como tripomastigotas metacíclicos transcrevem menos que as formas epimastigotas proliferativas, verificamos a presença da RNA polimerase II e medimos a atividade transcricional durante o processo de diferenciação. A presença da enzima e a atividade transcricional permanecem inalteradas durante todas as etapas da metaciclogênese, desaparecendo apenas quando as formas metacíclicas são formadas. Sugerimos que a diferenciação requer uma atividade transcricional, necessária para uma intensa remodelação da célula, que acontece até o cinetoplasto e o flagelo atingirem uma posição posterior do corpo do tripomastigota metacíclico.

Removal of Trypanosoma cruzi by white cell-reduction filters: an electronmicroscopic study

Os filtros de leucócitos säo eficazes em remover agentes infecciosos de hemocomponentes infectados. Neste estudo, foram avaliados os mecanismos de retençäo de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) por filtros de leucócitos. Amostras de concentrado de glóbulos vermelhos (CGV) e concentrado de plaquetas (CP) foram contaminados com parasitas T. cruzi (cepa Y, 3,4 x 10(6)/ml), e filtrados com filtros experimentais de leucócitos, com capacidade de remoçäo de aproximadamente 3 log(10) leucócitos. A análise das fibras dos filtros através de microscopia eletrônica de transmissäo mostrou que os parasitas T. cruzi foram removidos dos CGV e CP contaminados por mecanismo físico, sem interaçäo com células sangüíneas. Além disso, foi demonstrado que os parasitas T. cruzi foram também removidos por adesäo direta às fibras dos filtros, sugerindo um mecanismo biológico, provavelmente mediado por proteínas da superfície do parasita

Ultrastructural study of enteropathogenic Escherichia coli Olllab: H2 infection in an infant with acute diarrhea

Escherichia coli enteropatogênica clássica é o mais importante agente etiológico como causa de diarréia aguda nos países subdesenvolvidos, especialmente nos lactentes menores de uma ano de idade. As cepas de Escherichia coli enteropatogênica sao capazes de provocar profundas alteraçoes no citoesqueleto do enterócito, as quais sao denominadas aderência e apagamento das microvilosidades do enterócito, as quais sao denominadas aderência e apagamento das microvilosidades, associadas à formaçao de pedestais. Descreve-se uma cepa de Escherichia coli enteropatogênica 0111ab:H2 isolada das fezes de um lactente com diarréia aguda, no 11§ dia de doença, a qual provocou lesoes de aderência e apagamento das microvilosidades do enterócito e inclusive penetrou no interior do citoplasma do mesmo, assim como invadiu células HeLa em cultura de tecido in vitro e da mesma forma no teste da alça ileal ligada de coelho in vivo, todas as lesoes detectadas em estudo ultra-estrutural. Esta observaçao demonstra que lesoes graves da mucosa do intestino delgado causadas por uma cepa de Escherichia coli enteropatogênica 0111ab:H2 podem ocorrer ainda em um estágio precoce da infecçao entérica.

Development of trypanosomatids in the phytophagous insect Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrochoridae). A light and eletron microscopic study

Experimental infections of the phytophagous Hemiptera Dysdercus peruvianus with different trypanosomatids were studied for up to 55 days by light microscopy while the course of infection with Leptomonas seymouri and the Leptomonas isolate 49/553G.O. was analyzed by electron microscopy. Rates of infection of D. peruvianus varied according to the infecting flagellate. The lower part of the midgut was found to be the preferential site of colonization where most flagellates were found isolated or arranged in clumps or rosettes. Specialized junctional structures with host cells were never observed. Flagellates could also be seen inside midgut cells within a parasitophorous vacuole. Infection of haemocoele and salivary glands was also observed.

Microscopia eletronica de varredura da superficie epitelial do ileo em reservatorios ileais pelvicos e apos anastomose ileorretal / Scanning electron microscopy of the epithelial surface of the ileum in pelvic ileal reservoirs and after ileo rectalanastomisis

Os autores estudaram ao microscopio eletronico de varedura a superficie epitelial de reservatorios ileos em pacientes portadores de retocolite ulcerativa e polipose colica familial, tratados pela proctocolectomia com conservaçao esfincteriana. Analisaram grupos: mucosa ileal normal (5), mucosa de colo e reto normais (4), mucosa de reservatorios ileais (15), mucosa de ileo a montante de ileorreto anastomose (5). Fizeram biopsia da mucosa da bolsa ileal de 15 pacientes (13 com retocilite ulcerativa e dois com polipose colica familial) em diversos periodos do pos-operatorio tardio, desde um mes ate mais de quatro anos apos o fechamento da ileostomia. Observaram nitida alteraçoes da supeeficie da mucosa ileal em 14 dos 15 reservatorios ileais. No controle normal, as vilosidades eram digitiformes, enquanto que nos reservatorios ileais as mesmas apresentavam encurtamento e achatamento, resultando varias formas, com vilos circunvalados, papilares, foliados, em cordilheira, e as vezes notava-se aspecto cerebriforme da superficie epitelial. A mucosa dos reservatorios ileais, com frequencia, era plana quase que desprovida de vilosidade, apresentando unidades morfologicas circulares, lembrando roscas,assemelhando-se no conjunto a mucosa colica e retal normal. Em apenas um caso nao se observaram alteraçoes da superficie epitelial de reservatorios ileais; neste paciente a biopsia foi feita um mes apos o fechamento da ileostomia, e provavelmente nao houve tempo suficiente de exposiçao a corrente fecal. Todas as alteraçoes observadas ocorreram tanto nos paccientes com retocolite ulcerativa quanto naqueles com polipose colica familial. Concluiram que as alteraçoes observadas nao foram especificad ods resrvatorios ileais, uma vez que lesoes semelhantes ocorreram tambem na mucosa ileal de cinco pacientes submetidos a colectomia total com ileorreto anastomose ha mais de um ano. Nestes enfermos, a biopsia do ileo, cerca de 5cm acima da anastomose ileorretal tambem revelou colonizaçao da mucosa ileo, com encurtamento, achatamento e ate desaparecimento das vilosidades, com formaçao de unidades morfologicas circulares, semelhantes a roscas, lembrando o conjunto, o aspecto de mucosa retal normal.