Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR) / Methods of DNA extraction from archived materials and rare sources for utilization in polymer chain reaction

Este trabalho visou a comparação de cinco métodos diferentes de extração de DNA de materiais de arquivo (tecidos incluídos em parafina, esfregaços de sangue periférico - corados e não corados com Leishman, lâminas com mielogramas, gotas de sangue em Guthrie Card) e de fontes escassas (células bucais, um e três bulbos capilares e 2 mL de urina), para que fossem avaliadas a facilidade de aplicação e a facilidade de amplificação deste DNA pela técnica da reação de polimerização em cadeia (PCR). Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida ou não por purificação com fenol/clorofórmio; Chelex 100® (BioRad); Insta Gene® (BioRad) e fervura em água estéril. O DNA obtido foi testado para amplificação de três fragmentos gênicos: Brain-derived neutrophic factor (764 pb), Factor V Leiden (220 pb) e Abelson (106 pb). De acordo com o comprimento do fragmento gênico estudado, da fonte potencial de DNA e do método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização de procedimentos técnicos a serem incluídos no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro - HC - Unesp - Botucatu.

The present work aimed at comparing five different methods ofDNA extraction of samples from archived materials (paraffinembeddedtissues, peripheral blood smears - stained or not withLeishman, aspired bone marrow smears and Guthrie cardbloodspots) and from rare sources (oral cells, one and threecapillary bulbs, 2 mL of urine), to evaluate the ease of applicationand the possibility of amplification of this DNA by thepolymerization chain reaction (PCR) technique. The methodsincluded proteinase K digestion - followed or not by phenol/chloroform purification, Chelex 100® (BioRad), InstaGene®(BioRad) and boiling in the sterile water. The DNA obtained wastested for amplification of three genic fragments: the brain-derivedneutrophic factor gene (764 bp), the Factor V Leiden gene (220bp) and the Abelson gene (106 bp). According to the gene fragmentlength studied, the DNA potential source and the extraction methodused, the results characterized the best way to standardizetechnical procedures to be included in the Standard OperationalProcedure Manual of the Molecular Biology Laboratory of theBlood Center in the Medicine School of Unesp, Botucatu, Brazil.

Detecçäo de mRNAs quiméricos BCR/ABL em pacientes portadores de leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide aguda/mielóide aguda pela reaçäo de polimerizaçäo em cadeia (PCR) / Detection of BCR/ABL chimeric mRNAs in patients with chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia/ acute myeloid by polimerase chain reaction (PCR)

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença caracterizada pela proliferaçao e acumulaçao de células mielóides e seus precursores, induzida pela transformaçao neoplásica de uma célula hematopoética pluripotente, a stem-cell. Esse clone possui uma anormalidade citogenética que se caracteriza pela translocaçao recíproca entre os cromossomos 9 e 22 [t(9;22) (q34;q11)], resultando na formaçao do cromossomo Philadelphia (Ph1). O resultado dessa translocaçao é a justaposiçao do gene BCR com o protooncogene ABL, originando um gene híbrido que codifica uma proteína anormal com atividade tirosina quinase exacerbada. A reaçao de polimerizaçao em cadeia (PCR) baseada na amplificaçao do cDNA híbrido BCR/ABL tem sido considerada um meio altamente sensível e específico para detecçao dessa patologia, em nível molecular. O RNA total foi extraído pelo método de isocianato de guanidina, de leucócitos de sangue periférico e (ou) medula óssea. A primeira fita (cDNA) foi sintetizada utilizando primer complementar à regiao 3' do mRNA quimérico BCR/ABL, transcriptase reversa (Super Script II - Gibco-BRL) segundo sugestao do fabricante. A reaçao de PCR foi realizada em duas etapas: a primeira utilizando primers complementares à regiao BCR e ABL, num total de 25 ciclos com temperatura de 94 graus Celsius, 49 graus Celsius e 72 graus Celsius para desnaturaçao, anelamento e extensao, respectivamente; na segunda etapa foram utilizados primers internos aos primeiros (Nested-PCR) num total de 35 ciclos com temperatura de anelamento de 60 graus Celsius (primers sintetizados pela Genomic - Engenharia Molecular, SP). O controle de todo o procedimento técnico foi realizado pela amplificaçao de uma regiao do gene ABL. A presença de bandas características da LMC foram visualizadas após eletroforese em gel de poliacrilamida 6 por cento e coloraçao por brometo de etídio. O método foi considerado extremamente sensível e rápido para a detecçao da t(9;22) quando comparada com a citogenética convencional.

Efeitos de subdoses de halotano e óxido nitroso em ratos / Effects of subdoses of halothane and nitrous oxide in rats

Background and Objectives - Chronic inhalation of anesthetic agents, due to their residual and additive effects, can produce deleterious changes in different organs and systems. The purpose of this experimental study was to evaluate some organic alterations in animals exposed to the chronic inhalation of halothane and nitrous oxide. Methods - The effects of subdoses of inhalational anesthetics were evaluated in 80 rats, 40 male and 40 female, allocated into 4 groups of 20 animals. Group 1: animals breathing room air; Group 2: halothane 50 ppm; Group 3: nitrous oxide 400 ppm; Group 4: halothane 50 ppm and nitrous oxide 400 ppm. The animals were exposed to the experimental conditions 6 hours per day, for 180 days. The following parameters were observed: blood cells (segmented leukocytes, lymphocytes, eosinophils, monocytes); electrolytes (sodium, potassium, calcium); glutamic-oxalacetic and glutamic-piruvic transaminases, prolactine, stradiol, creatinine and glycemia; weight gain; histopathologic changes in differents organs (brain, heart, liver, kidney, testicle, aorta, stomach, bone marrow). Results - The histopathologic study showed normal organs in all groups. Stradiol and prolactine levels were bellow the limit of detection of the method. Transaminase were significantly reduced. In Groups 2 and 3 there was reduction in the levels of sodium, calcium, glucose, creatinine and of weight gain; in Group 3 the percentage of eosinophils were also reduced. In Group 4, the reduction i the same parameters were greater, with the additional reduction of potassium levels and segmented leukocytes; the percentage of pymphocytes and eosinophils increased and the monocytes remained unchanged. Conclusions - Under the experimental conditions, the simultaneous chronic inhalation of halothane and nitrous oxide induced greater changes as compared to the inhalation of each individual agent. Despiste alterations in biochemical data, blood cells and weight gain, no histopathological abnormality was observed

Detecçäo de monoclonalidade em linfócitos do sangue periférico de pacientes portadores de leucemia linfocítica crônica pela reaçäo em cadeia da polimerase / Detection of monoclonicity in peripheric blood lymphocytes in patients with chronic lymphocytic leukemia by polymerase chain reaction

O rearranjo gênico da cadeia pesada de imunoglobulina é um fenômeno que ocorre precocemente durante a ontogênese do sistema linfóide B, permitindo a aproximaçäo da regiäo variável (VH) da regiäo juncional (JH, as quais flanqueiam a regiäo de diversidade (DH), de tal modo que o fragmento (VHDHJH, originado desse rearranjo torna-se acessível à amplificaçäo pela reaçäo em cadeia da polimerase (PCR). A partir de linfócitos de sangue periférico de 7 pacientes portadores de LLC, utilizando 2 "primers" complementares a sítios conservados das regiöes VH e JH, foi amplificado um fragmento que após eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5 por cento e coloraçäo pela prata, mostrou ser monoclonal. A presença dessa banda monoclonal foi mantida em diluiçöes sequenciais, as quais envolveram a mistura do DNA tumoral com DNA normal, até inclusive o nível de 1 por cento de DNA tumoral. A técnica da PCR revelada pela prata, mostrou-se sensível na detecçäo de monoclonalidade em pacientes portadores de LLC, sem necessidade do uso de sondas.

Síndromes mielodisplásicas: avaliaçäo clínica, hematológica e histopatológica da medula óssea em 23 casos / Myelodysplastic syndromes: clinical, hematological and histological evaluation of bone marrow in 23 cases

As mielodisplasias säo síndromes mieloproliferativas, com possível evoluçäo para leucemia aguda, mal conceituadas e com rica sinonímia. Com o objetivo de contribuir para seu melhor conhecimento, revimos os aspectos clínicos, laboratoriais (hemoglobina fetal, ferro sérico, transferrina) e morfológicos (hemograma, mielograma e biópsia de aspiraçäo de medula óssea) de 23 casos. Os casos foram distribuídos segundo o grupo cooperativo FAB (French-American-British): 1) anemia refratária (RA) - cinco casos; 2) RA com sideroblastos (RAS) - quatro casos; 3) leucemia mielomonocítica crônica (LMMoC) - nenhum caso; 4) RA com excesso de blastos (RAEB) - três casos; e 5) RAEB com transformaçäo leucêmica (RAEBt) - 11 casos. Nos casos limítrofes ou com hipocelularidade medular, o estudo histológico de medula óssea foi essencial para a classificaçäo, com ênfase no encontro de agregados blásticos centrais, achado indicativo de transformaçäo leucêmica iminente