Estandarización de un ensayo inmunoenzimático para la detección de anticuerpos anti-ADN doble cadena en el lupus eritematoso sistémico / Standardization of an immunoenzymatic assay to detect anti-double-stranded DNA antibodies in systemic lupus erythematosus

Introducción: los anticuerpos anti-ADN doble cadena son un marcador serológico diagnóstico de lupus eritematoso sistémico (LES). El ensayo inmunoenzimático en fase sólida es una técnica rápida y rentable para su detección. Objetivo: estandarizar un ELISA que detecte anti ADN doble cadena para el diagnóstico del lupus. Métodos: los pasos que se siguieron para la estandarización incluyeron la preparación de controles, la sensibilización de la fase sólida, la selección de los amortiguadores y conjugado del ensayo, la evaluación de las condiciones de reacción y la determinación del nivel de corte. Además se realizó el estudio de inespecificidades. Se probaron 5 tipos de placas de poliestireno y se compararon ADN plasmádico de E.coli, pUC19 y ADN genómico humano como antígenos de recubrimiento. Se evaluó el efecto de la poli-L-lisina y la irradiación de la placa con luz ultravioleta, en la fijación del antígeno. El valor de corte del ensayo se determinó por el método del valor límite. Resultados: se observó disociación del antígeno cuando no se utilizó poli-L-lisina en el pretratamiento de la placa y la irradiación con luz UV no favoreció la unión del ADN a la fase sólida. No se encontraron diferencias significativas (p=0,710) entre ambos ADN, en el recubrimiento. El valor de corte (K=3) permitió clasificar como positivas 28 muestras (63,6 porciento) de pacientes con LES. Conclusiones: el método estandarizado, con el empleo de ADN plasmádico, permitió la detección de anticuerpos anti-ADN doble cadena en pacientes con lupus

Introduction: anti-double-stranded DNA antibodies are a diagnostic serological marker for systemic lupus erythematosus (SLE). The solid-phase immunoenzymatic assay is a rapid, cost-effective technique for their detection. Objective: Standardize an ELISA detecting anti-double-stranded DNA for the diagnosis of lupus. Methods: the standardization process included the following steps: preparation of controls, sensitization of the solid phase, selection of buffers and assay conjugate, evaluation of reaction conditions and determination of the cut-off level. A study of unspecificities was also conducted. Five types of polystyrene plates were tested, and a comparison was made of E. coli (pUC19) plasmid DNA and human genomic DNA as coating antigens. An evaluation was conducted of the effect of poly (L-lysine) and irradiation of the plate with ultraviolet light upon antigen fixation. The assay cut-off value was determined by the limit value method. Results: antigen dissociation was observed when poly (L-lysine) was not used in the pretreatment of the plate and UV light irradiation did not foster DNA binding to the solid phase. No significant differences were found (p=0.710) between the two DNA coatings. The cut-off value (K=3) made it possible to classify 28 samples of patients with SLE as positive (63.6 percent). Conclusions: the method standardized with the use of plasmid DNA enabled detection of anti-double-stranded DNA antibodies in patients with lupus

Estabilidad de un suero control multienzimático utilizado como material de referencia en los laboratorios clínicos / Stability of a multienzyme control serum used as reference material in clinical laboratories

Una de las vías fundamentales para garantizar la calidad de los ensayos realizados en los laboratorios clínicos es mediante el uso de materiales de referencia. Una problemática a la que nos enfrentamos es la escasez de estos productos en el mercado nacional dado su alto costo. Objetivo: evaluar la estabilidad de un suero bovino adulto enriquecido con las enzimas alanina aminotransferasa (ALAT/TGP), aspartato aminotransferasa (ASAT/TGP), fosfatasa alcalina (FA) y amilasa. Métodos: se evaluó la estabilidad a tiempo real de la matriz enriquecida con las diferentes enzimas durante 12 meses a 2 temperaturas (refrigeración y congelación). Se evaluó el efecto del glicerol sobre la actividad enzimática de los extractos, así como el efecto de los preservantes propilenglicol y etilenglicol en la estabilidad de las enzimas. Resultados: los extractos enzimáticos obtenidos comenzaron a perder la actividad biológica a partir de los 15 días, independientemente de la temperatura de almacenamiento y de la presencia o no de glicerol. Los resultados del ensayo a tiempo real realizados a la matriz enriquecida, mostraron que la estabilidad varió con el tiempo y con el tipo de enzima, independientemente del preservante ensayado, disminuyendo por debajo de los límites aceptables de actividad enzimática luego de 3 meses de almacenamiento del producto a 4 ºC. Conclusiones: se logró un material de referencia multienzimático estable por un período de 3 meses

A fundamental method to assure the quality of clinical laboratory tests is the use of reference materials. A problem we are faced with is the scarcity of these products in the domestic market, due their high cost. Objective: Evaluate the stability of an adult bovine serum enriched with the enzymes alanine aminotransferase (ALT, GPT), aspartate aminotransferase (AST, GPT), alkaline phosphatase (AP) and amylase. Methods: This enzyme-enriched matrix underwent real-time stability assessment during 12 months at two temperatures (refrigerated and frozen). An evaluation was made of the effect of glycerol on the enzymatic activity of extracts, as well as the effect of the preservatives propylene glycol and ethylene glycol on enzymatic stability. Results: The enzyme extracts obtained began to lose their biological activity at 15 days, irrespective of the storage temperature and the presence or absence of glycerol. The real time assessment of the enriched matrix showed that stability varied with time and enzyme type, irrespective of the preservative tested, and fell below acceptable limits of enzymatic activity after three months of storage at 4 ºC. Conclusions: A multienzyme reference material was obtained which was stable for a period of 3 months

Caracterización electroforética y cromatográfica del veneno del alacrán Rhopalurus junceus / Electrophoretic and chromatographic characterization of the Rhopalurus junceus scorpion venom

El veneno del alacrán azul, Rhopalurus junceus es actualmente comercializado con el nombre de Escozul. Este producto natural se emplea en el tratamiento de diferentes patologías, sin embargo en la literatura revisada no aparece información referente a la caracterización bioquímica del extracto de este ejemplar cubano. Objetivo: hacer una caracterización bioquímica preliminar del veneno crudo del alacrán cubano mediante el empleo de dos técnicas destinadas a estos fines. Método: se empleó la electroforesis discontinua de proteínas en gel de poliacrilamida al 15% y la cromatografía de alta presión. Resultados: se identificó un patrón difuso correspondiente a péptidos de talla inferiores a catorce KDa, mientras que por HPLC se determinaron trece picos en el veneno crudo de esta especie. Conclusiones: el veneno del alacrán azul presenta una composición molecular similar a la descrita para otras especies con una mezcla molecular inferior a catorce KDa.

The blue scorpion venom, Rhopalurus junceus is currently marketed with the name of Escozul. This natural product is used in the treatment of different pathologies; however in the revised literature doesn't appear concerning information to the biochemical characterization of the extract of this Cuban specimen. Objective: to make a preliminary biochemical characterization on the crude venom of the Cuban scorpion by means of the employment of two techniques dedicated to these purposes. Method: the discontinuous electrophoresis of proteins was used in polyacrylamide to 15% and the chromatography of high pressure. Results: a diffuse pattern corresponding to inferior size peptides to fourteen KDa was identified, while for HPLC thirteen peaks were determined in the crude venom of this species. Conclusions: the blue scorpion venom presents a similar molecular composition to the one described for other species with an inferior molecular mixture to fourteen KDa.

Evaluación de la toxicidad in vitro del veneno del alacrán Rophalurus junceus a través de un ensayo celular / In vitro toxicity assessment caused by Rophalurus junceus scorpion poison though a cellular assay

El veneno del alacrán azul, Rophalurus junceus es comercializado con el nombre de Escozul. Este producto natural se emplea en el tratamiento de diferentes patologías. Este trabajo evaluó el efecto citotóxico in vitro de este producto en las líneas tumorales P3-X63/AG8/653 y Dunning R3327-G provenientes de mieloma murino y próstata de rata, respectivamente. La citotoxicidad fue evaluada mediante la cinética de crecimiento celular y el daño metabólico. Se utilizaron dosis de 1, 10, 20, 50, 100 y 200 mg/mL. El veneno presentó un efecto citostático dependiente de la línea tumoral en cuestión. Las dosis efectivas variaron entre las líneas celulares ensayadas. Se estudió además la estabilidad del producto almacenado durante 30 días a temperaturas de -20 y 4ºC, se evidenció la pérdida de la actividad biológica. El trabajo demostró la citotoxicidad del veneno crudo del alacrán azul en cultivos celulares.

Poison of blue scorpion (Rophalurus junceus) is marketed as Escozul. This natural product is used in treatment of different pathologies. Present paper evaluated the in vitro cytotoxic effect of this product in P3-X63/AG8/653 and Dunning R3327-G tumor lines from murine myeloma and rat prostate, respectively. Cytotoxic effect was evaluated by means of cellular growing kinetics and the metabolic damage. Doses of 1,10, 20, 50, 100, and 200 ìg/mL. Poison had a cytostatic effect dependent of tumor line at issue. Doses effective varied among the cellular lines assessed. We studied also stability of product stored during 30 days at temperatures of -20° and 4° C, evidenced the loss of biological activity. We showed cytotoxic effect of crude poison of blue scorpion in cellular cultures.

Purificación de ADN genómico humano para el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico / Purification of human genomic DNA for the diagnosis of the systemic lupus erythematosus

Fundamento: La molécula de ADN constituye un antígeno necesario en el recubrimiento de un sistema inmunoenzimático destinado al diagnóstico de enfermedades autoinmunes, específicamente del lupus eritomatoso sistémico. Por otra parte, esta molécula se emplea en la obtención de anticuerpos monoclonales anti ADN de doble cadena. Objetivo: Se evaluó la calidad del ADN humano purificado por el método del fenol:cloroformo con fines diagnósticos. La molécula fue obtenida por primera vez en el Centro de Inmunología y Productos Biológicos de Camagüey. Método: El ADN se extrajo a partir de tejido prostático de un paciente con hiperplasia prostática benigna. Se realizó la técnica convencional de fenol: cloroformo/alcohol isoamilico. El tejido fue previamente tratado con Pronasa a 56ºC. La corrida electroforética se realizó en gel de agarosa 0,8 %, y se determinó la relación 260/280nm mediante espectrofotometría, con la finalidad de evaluar la integridad de la macromolécula, así como el grado de pureza de la misma respectivamente. Resultados: No se observó degradación de la molécula de ADN genómico humano, y la relación 260/280 fue de 1,6. La molécula de ADN humana fue ensayada en el recubrimiento de un ELISA destinado al diagnóstico del Lupus, y su comparación con ADN plásmidico no arrojó diferencias significativas (p= 0.710). Conclusiones: El método aquí descrito proporcionó una molécula de ácido nucleico con la calidad requerida para ser utilizada en el sistema inmunoenzimático destinado al diagnóstico del lupus eritematoso sistémico.

Background: The DNA molecule constitutes a necessary antigen in the capping of an immunoenzymatic system dedicated to the diagnosis of autoimmune diseases, specifically of the systemic lupus erythematosus. On the other hand, this molecule is used for obtaining the anti DNA monoclonal antibodies´ of double chain. Objective: The quality of the purified human DNA was evaluated by the phenol method: chloroform with diagnostic purposes. The molecule for the first time was obtained in the Center of Immunology and Biological Products of Camagüey. Method: The DNA was extracted from a patient's prostatic tissue with benign prostatic hyperplasia. The conventional technique of phenol: chloroform / isoamyl alcohol was perfomed. The tissue was previously treated with Pronasa at 56ºC. The agarose gel electrophoresis was performed at 0,8% and the relationship 260/280nm was determined by spectrophotometry, with the purpose of evaluating the integrity of the macromolecule, as well as its grade of purity respectively. Results: It was not observed degradation of the human genomic DNA molecule, and the relationship 260/280 was about 1,6. The human DNA molecule was tested in the capping of an ELISA dedicated to lupus diagnosis, and its comparison with plasmid DNA did not show significant differences (p = 0.710). Conclusions: The described method, provided a nucleic acid molecule with the quality required to be used in the immunoenzymatic system dedicated to the diagnosis of the systemic lupus erythematosus.

Cambios en la actividad biológica de un antígeno debido a la temperatura generada durante la electroforesis de poliacrilamida / Changes in the biological activity of an antigen due to the temperature generated during the polyacrylamide electrophoresis

Se evaluó el efecto que origina la temperatura sobre la actividad biológica de un antígeno durante la electroforesis en geles no reductores de poliacrilamida, porque en ocasiones la técnica precede a la electroelusión, método empleado en la purificación de determinadas proteínas. Se utilizó el antígeno específico prostático para el ensayo, este se purificó a partir del semen de pacientes voluntarios, precipitado con sulfato de amonio 70 por ciento. Las corridas (3 para cada temperatura), se llevaron a cabo a 4 y 25 °C, y se realizaron a 20 mA. Para cada temperatura ensayada, los fragmentos provenientes de los geles cortados a la talla esperada para el antígeno específico prostático (33 kDa), se electroeluyeron a 4 °C. Mediante la comparación de las concentraciones de proteínas empleando la técnica de Lowry y el método radioinmunoenzimático, se cuantificó la cantidad de proteína biológicamente activa posterior a la electroforesis. Se utilizó un antígeno específico prostático comercial como control. Los resultados indican que el antígeno a 4 °C, conserva 80 por ciento de su actividad biológica, lo que no sucede a 25 °C donde más de 50 por ciento de la proteína es biológicamente inactiva

Purificación del antígeno específico prostático con alto grado de pureza mediante el método de electroelusión / Purification of prostatic specific antigen of high purity level through the electroelusión method

Se evaluó la utilidad de la técnica de electroelusión en la obtención del antígeno específico prostático con actividad biológica para su empleo en sistemas basados en el reconocimiento antígeno-anticuerpo (ELISA, RIA, SUMA). Para la muestra se partió del semen de pacientes voluntarios, precipitados con sulfato de amonio al 70 por ciento. Las corridas electroforéticas en geles de poliacrilamida no reducidos se llevaron a cabo a 4º C. Se procedió a electroeluir el fragmento de acrilamida cortado en la talla deseada (33 KDa) y para ello se utilizaron marcadores adecuados de peso molecular. La metodología empleada permitió obtener un antígeno con un grado de pureza próximo al 70 por ciento. El método de electroelusión constituye un procedimiento rápido y poco costoso para su uso en laboratorios con bajos recursos. Los resultados aquí obtenidos no mostraron diferencias significativas (p=0.181) con el PSA purificado por el método cromatográfico, lo que sugiere su uso en obtención del antígeno específico prostático y otras moléculas para tales fines

Plasma equino como sustituto del plasma humano en la identificación del staphylococcus aureus en los laboratorios de microbiología / Equine plasma as a substitute of human plasma in the identification of staphylococcus aureus in microbiology laboratories

Se evaluaron varios plasmas de diferentes especies y se trabajó un total de 106 cepas, por los problemas éticos que impone este plasma, así como la baja sensibilidad en la identificación de cepas de Staphylococcus aureus. Esta se realiza en los laboratorios microbiológicos de la red hospitalaria nacional con plasma de origen humano. Se estudió el efecto de la dilución, del tiempo de incubación, así como la influencia del sexo en la identificación de las cepas positivas (índice de positividad). Se determinaron las condiciones óptimas de trabajo, las cuales no difirieron significativamente de los resultados obtenidos con el plasma de conejo. El plasma humano mostró ser poco efectivo en la identificación de cepas positivas (57,5 por ciento), revelando diferencias significativas con el plasma de conejo y del equino (95,3 y 94,3 por ciento, respectivamente). Los resultados aquí obtenidos sugieren la sustitución del plasma humano por el plasma equino en los laboratorios microbiológicos para la identificación de este microorganismo patógeno. Este plasma mostró ser estable a - 20 ºC por un período de 12 meses

Saphylococcus aureus y su identificación en los laboratorios microbiológicos: revisión bibliográfica / Staphylococcus aureus and its identification in microbiologic labs: bibliographical review

Se realizó un compendio con más de 30 publicaciones que abordan las nuevas investigaciones sobre los principales elementos que intervienen en el mecanismo de infección y los métodos diagnósticos más utilizados para la detección del Staphylococcus aureus por parte de los laboratorios microbiológicos en el mundo y Cuba. Nuevas moléculas que contribuyeron al proceso infectivo del ente se encuentran en fase de estudio, para algunas de ellas se describió su papel en el mecanismo. El método más difundido en nuestro país es el ensayo de la coagulasa en tubo. Se decidió informar los métodos más utilizados en el diagnóstico de esta entidad, incluyendo los más recientes, aún en fase de estudio y estandarización en algunos casos, así como brindar algunos de los elementos básicos o factores que intervienen en el mecanismo de infección