Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B / Real-time polymerase chain reaction assay for Hepatitis B virus DNA quantification

Introducción: los niveles de ADN viral en muestras de suero son un marcador útil para monitorear la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en pacientes con hepatitis B crónica; de ahí que se comercialicen estuches diagnósticos para esta función, con la desventaja de ser costosos. Objetivos: desarrollar y evaluar el desempeño analítico de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B. Métodos: se utilizaron cebadores que amplifican un fragmento del gen C y sonda de hidrólisis en el equipo LightCycler 1.5. Se construyó una curva estándar y se evaluó su eficiencia. Se utilizaron 272 muestras de suero para ensayos de especificidad analítica y clínica, especificidad y exactitud genotípica, coeficientes de variación intraensayo e interensayo, comparación con un estuche comercial y con la reacción en cadena de la polimerasa cualitativa para el virus de la hepatitis B. Resultados: la curva estándar mostró excelente correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de varias magnitudes de concentración de ADN diana. La especificidad analítica y clínica fue de 100 %, en tanto que al evaluar la especificidad y exactitud genotípica, se obtuvo que las diferencias entre los Log10 del valor obtenido y el de referencia eran inferiores a 0,5 Log10. El límite de detección por análisis de Probit se estimó en 16,41 UI/µL con un rango dinámico de cuantificación de hasta 10(8) UI/mL. El sistema mostró bajos coeficientes de variación intraensayo (0,16 a 1,45 %) e interensayo (0,9 a 2,62 %). La comparación con el estuche comercial artus HBV LC PCR kit mostró una correlación de r= 0,964 y r²= 0,929; con la reacción en cadena de la polimerasa cualitativa se confirmó la mayor sensibilidad y ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Conclusiones: el ensayo cumple con los requisitos para la cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B, que demuestra ser específico, sensible y reproducible. Su aplicación permitirá un mejor diagnóstico y seguimiento de los pacientes con hepatitis B crónica en Cuba.

Introduction: viral DNA levels in serum samples are a useful marker to monitor the disease progression and the treatment response in patients with chronic hepatitis B. Commercial kits for this purpose are available, but they are considerably expensive. Objectives: to evaluate the analytical performance of a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for Hepatitis B virus DNA quantification. Methods: specific primers to the gene C and TaqMan chemistry in a LightCycler 1.5 equipment was used. A standard curve was made and evaluated. Two hundred and seventy-two serum samples were used to assess the clinical and analytical specificity, the genotypic accuracy and specificity, the intra-assay and interassay coefficients of variation and the comparison with a commercial assay and with the qualitative PCR. Results: the standard curve showed a strong linear correlation (r= -1) and low error values in the tested target DNA concentration. Analytical and clinical specificities were 100 %. Genotype accuracy and specificity showed that the differences between the results obtained by RT-PCR assay and those of the reference assay were less than 0.5 Log10. The 95% HBV DNA detection end-point assessed by Probit analysis was 16.41 IU/µL with a dynamic range of quantification of 10(8) IU/mL. Intra-assay and interassay coefficients of variation ranged from 0.16 to 1.45 % and 0.9 to 2.62 % respectively. The RT-PCR assay correlated well with those from a commercial assay (r= 0.964 and r²= 0.929) and with the HBV qualitative PCR, thus confirming its better sensitivity and advantages. Conclusions: the RT-PCR assay is well suited to monitoring HBV DNA levels showing to be sensitive, specific and reproducible. Its application in the clinical practice ensures a better diagnosis and management of patients with chronic hepatitis B in Cuba.

Asociación del virus herpes humano 8 y la hiperplasia linfoide nodular difusa del intestino delgado en la inmunodeficiencia variable común / Association between the human herpesvirus 8 and the diffuse nodular lymphoid hyperplasia of the small intestine in common variable immunodeficiency

La inmunodeficiencia variable común (IDVC) es la inmunodeficiencia primaria más frecuente en el terreno clínico y sus formas de presentación son muy variables. Se describe una paciente con IDVC de adulto con síndrome diarreico crónico, pérdida de peso y linfoadenopatías difusas. Sus características inmunológicas más notables fueron una profunda hipogammaglobulinemia de las 3 clases mayores de inmunoglobulinas y la disminución numérica de las células B (CD19+) y células NK (CD3-CD56+) en sangre periférica. La biopsia del intestino delgado obtenida por panendoscopia asistida por video, reveló hiperplasia linfoide multinodular con atrofia parcial de las vellosidades. La inmunohistoquímica mostró que los nódulos consistían en centros germinales aumentados de tamaño con una distribución de células B (CD20+) y células T (CD3+), similar a la del folículo normal. No se encontró expresión diferencial de cadenas ligeras κ y λ. El método de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (QRT-PCR) detectó un número apreciable de copias del genoma del virus del herpes humano tipo 8 (VHH-8) (133 copias/µL de ADN) en el ADN del nódulo intestinal biopsiado. La infección con el VHH-8 puede ser un factor importante en la patogenia de los trastornos linfoproliferativos en pacientes con IDVC.

The common variable immunodeficiency (CVID) is the more frequent primary immunodeficiency in clinical field and its presentation forms are very variable. We describe the case of a women presenting with adult CVID with chronic diarrhea syndrome, weight loss and diffuse lymphadenopathies, where the more marked immunologic features were a deep hypogammaglobulinemia of the three major kinds of immunoglobulins and numerical decrease of B cells (CD19+) and NK cells (CD3-CD56+) in peripheral blood. Biopsy of small intestine obtained by video-assisted panendoscope, showed the presence of a multinodular lymphoid hyperplasia with partial atrophy of hairinesses. Immunohistochemistry showed that nodules were high germinal centers with distribution of B cells (CD20+) and T cells (CD3+), similar to that of normal follicle. There was not differential expression of the K and λ light chains. The real time polymerase chain reaction (QRT-PCR) method detected many copies from the genome of type 8 human herpesvirus (VHH-8) (133 copies/µL of DNA) in biopsy of intestinal nodule DNA. VHH-8 infection may to be a significant factor in pathogenesis of lymphoproliferative disorders in patients presenting with CVID.

Normalización de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del herpesvirus humano 8 / Standardization of a real-time polymerase chain reaction system for quantification of human herpesvirus 8

OBJETIVO: normalizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar la carga viral del herpesvirus humano 8, en diferentes muestras clínicas de pacientes en los que se sospeche la infección por este agente. MÉTODOS: se evaluaron 3 de los métodos reportados internacionalmente para obtener ADN estándar en la construcción de curvas externas estándar, que permiten determinar el número de copias de ADN diana en la muestra problema. RESULTADOS: se obtuvieron 3 ADN estándar a partir del clonaje de un fragmento del gen ORF26 del herpesvirus humano 8 en un vector (ADN plasmídico), con la utilización de productos purificados de reacción en cadena de la polimerasa y el empleo de ADN genómico de la línea celular BCBL. Se pudieron construir las curvas patrón a partir de cada uno de los ADN estándar obtenidos, los que mostraron una fuerte correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de 6 magnitudes de concentración de ADN diana. El límite inferior de detección a partir del ADN plasmídico y de los productos de reacción en cadena de la polimerasa fue de hasta 100 copias, mientras que con el ADN genómico fue de hasta 10 copias; este último sistema resultó el más sensible. CONCLUSIONES: la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real normalizada a partir de los 3 ADN estándar probó ser un sistema rápido, específico y altamente sensible que permitirá un mejor diagnóstico y además desarrollar estudios sobre la patogenia de la infección por el herpesvirus humano 8 en Cuba.

OBJECTIVE: to standardize a real-time polymerase chain reaction system to determine the human herpes virus 8 viral load in several samples from patients suspected of this type of infection. METHODS: three internationally known methods were evaluated to obtain standard DNA in standard external curve constructions, which allow determining the number of target DNA copies in the suspected samples. RESULTS: three standards DNA were obtained from cloning ORF26 gene fragment of human herpesvirus 8 in a vector (plasmid DNA), with the use of purified polymerase chain reaction products and of genomic DNA of BCBL cell lines. The pattern curves were constructed on the basis of each of the resulting standard DNA, which showed strong linear correlation (r= -1) and very low error values throughout 6 target DNA concentrations. The lower detection limit based on plasmid DNA and the polymerase chain reaction products was 100 copies, whereas that obtained with genomic DNA reached up to 10 copies; this last system turned to be the most susceptible. CONCLUSIONS: real-time polymerase chain reaction system, standardized for the three standard DNA proved to be a rapid, specific and highly sensitive system for better diagnosis, and for the development of studies on the pathogenesis of human herpesvirus 8 infection in Cuba.