Validation of PCR method for mycoplasma detection in the Yellow Fever-vaccine quality control / Validação de método de PCR para detecção de micoplasmasno controle de qualidade da vacina de Febre Amarela

Among the vaccines produced by Bio-Manguinhos, a major centre for manufacturingthe immunobiological products in Latin America, stands out the yellow fever (YF) vaccine.To guarantee the excellence and safety of the YF vaccine, the quality control tests has to be performedthroughout its production. The World Health Organization (WHO) demands the producersto guarantee the absence of Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum and M. synoviaein the biological products. Mycoplasma is a fastidious microorganism, requiring about 35 daysfor attaining the conclusive culturing test. In this study PCR methods were selected for amplifying16S rRNA gene fragments for detecting mycoplasma in the intermediate products of YF vaccine.This standardized methodology was specific and sensitive to detect the low concentrations of mycoplasma in spiked intermediary vaccine products; and the absence of unspecific amplification was also demonstrated. The detection rates ranged from 3.1 to 12.5 colony formingunits and showed 100 % of sensitivity and specificity in the tested samples. The PCR protocol for detecting mycoplasmal DNA in YF vaccine was validated by analysing 286 samples. Bio-Manguinhos produces annually 10,000,000 YF vaccine doses, and this method has been successfully employed, complementing the traditional approach in the mycoplasma detection since 2008.

Dentre as vacinas produzidas por Bio-Manguinhos, um importante centro de produção deimunobiológicos da América Latina, destaca-se a vacina de febre amarela (FA) que é produzidaem ovos embrionados. Para garantir a excelência e a segurança da vacina, testes de controlede qualidade são realizados durante a produção. A Organização Mundial de Saúde (OMS) exigedos produtores a ausência de Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum e M. synoviaeem produtos biológicos. Micoplasmas são micro-organismos fastidiosos, sendo necessários35 dias para que os testes de cultura sejam conclusivos. Neste estudo foram selecionadosmétodos de amplificação de fragmentos do gene 16S rRNA para detecção de micoplasmas emprodutos intermediários da vacina de FA. Esta metodologia padronizada foi capaz de detectarbaixas concentrações de micoplasmas nos produtos intermediários e a ausência de amplificaçãoinespecífica foi demonstrada. O limite de detecção variou entre 3,1 e 12,5 unidades formadorasde colônia; e nas amostras testadas a sensibilidade e a especificidade foram de 100 %. O protocolode PCR para detecção de micoplasmas na vacina foi validado pela análise de 286 amostras.Bio-Manguinhos produz 10.000.000 doses de vacina de febre amarela por ano e, desde 2008,este método tem sido empregado com sucesso, complementando-se a abordagem tradicional.

Validation of PCR method for mycoplasma detection in the Yellow Fever-vaccine quality control / Validação de método de PCR para detecção de micoplasmas no controle de qualidade da vacina de Febre Amarela

Among the vaccines produced by Bio-Manguinhos, a major centre for manufacturing the immunobiological products in Latin America, stands out the yellow fever (YF) vaccine. To guarantee the excellence and safety of the YF vaccine, the quality control tests has to be performed throughout its production. The World Health Organization (WHO) demands the producers to guarantee the absence of Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum and M. synoviae in the biological products. Mycoplasma is a fastidious microorganism, requiring about 35 days for attaining the conclusive culturing test. In this study PCR methods were selected for amplifying 16S rRNA gene fragments for detecting mycoplasma in the intermediate products of YF vaccine. This standardized methodology was specific and sensitive to detect the low concentrations of mycoplasma in spiked intermediary vaccine products; and the absence of unspecific amplification was also demonstrated. The detection rates ranged from 3.1 to 12.5 colony forming units and showed 100 % of sensitivity and specificity in the tested samples. The PCR protocol for detecting mycoplasmal DNA in YF vaccine was validated by analysing 286 samples. Bio-Manguinhos produces annually 10,000,000 YF vaccine doses, and this method has been successfully employed, complementing the traditional approach in the mycoplasma detection since 2008.

Dentre as vacinas produzidas por Bio-Manguinhos, um importante centro de produção de imunobiológicos da América Latina, destaca-se a vacina de febre amarela (FA) que é produzida em ovos embrionados. Para garantir a excelência e a segurança da vacina, testes de controle de qualidade são realizados durante a produção. A Organização Mundial de Saúde (OMS) exige dos produtores a ausência de Mycoplasma orale, M. pneumoniae, M. gallisepticum e M. synoviae em produtos biológicos. Micoplasmas são micro-organismos fastidiosos, sendo necessários 35 dias para que os testes de cultura sejam conclusivos. Neste estudo foram selecionados métodos de amplificação de fragmentos do gene 16S rRNA para detecção de micoplasmas em produtos intermediários da vacina de FA. Esta metodologia padronizada foi capaz de detectar baixas concentrações de micoplasmas nos produtos intermediários e a ausência de amplificação inespecífica foi demonstrada. O limite de detecção variou entre 3,1 e 12,5 unidades formadoras de colônia; e nas amostras testadas a sensibilidade e a especificidade foram de 100 %. O protocolo de PCR para detecção de micoplasmas na vacina foi validado pela análise de 286 amostras. Bio-Manguinhos produz 10.000.000 doses de vacina de febre amarela por ano e, desde 2008, este método tem sido empregado com sucesso, complementando-se a abordagem tradicional.

Desenvolvimento de um modelo de avaliação de protótipos vacinais em linhagem de monócito humana (THP-1) / Development of an evaluation model prototype vaccine strain in human monocyte (THP-1)

As culturas de células vêm sendo utilizadas extensivamente no desenvolvimento e na produção de uma variedade de produtos terapêuticos e profiláticos, tornando-se uma ferramenta indispensável para geneticistas, imunologistas, vacinologistas e a indústria farmacêutica. A adoção de sistemas de ensaios celulares in vitro tem sido aplicada como um método alternativo para a substituição ou diminuição do uso de animais nas fases de desenvolvimento, produção e testes de vacinas, demonstrando resultados promissores. Da mesma forma, sistemas computacionais podem ampliar a utilização desta ferramenta para etapas do desenvolvimento de vacinas candidatas na fase pré-clínica. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um protocolo in vitro utilizando culturas de células humanas – a linhagem de monócitos THP-1, para a seleção de um protótipo vacinal – a cepa Pasteur de Mycobacterium bovis BCG expressando o antígeno Sm14 de Schistossoma mansoni (BCG/sm14). Para isso foram empregadas duas metodologias – citometria de fluxo e imunocitoquímica, para a identificação do perfil da expressão das citocinas IL-10, IL-12 e TNF- alfa. Foram utilizados como controles a cepa Pasteur do M. bovis BCG e a construção da cepa Pasteur do M. bovis BCG contendo o vetor de expressão pAU5 (BCG/pAU5). Após padronização, a multiplicidade de infecção utilizada para os experimentos foi de 10 bacilos para 1 célula THP-1 (10MOI). A expressão da proteína Sm14 foi detectada em todos os protótipos vacinais. Para assegurar que o protótipo BCG/sm14 era capaz de diferenciar a linhagem de monócitos THP-1 em macrófagos, avaliamos a taxa de crescimento celular e foi possível observar que após a infecção estas células apresentavam o índice de proliferação diminuído em 2 logs em relação à célula não infectada. O protótipo vacinal BCG/sm14 não mostrou diferenças quanto a capacidade de infecção, a taxa de persistência intracelular e a estabilidade da construção plasmidial. As duas metodologias empregadas mostraram resultados discrepantes em relação ao percentual de citocinas expressas após a infecção com o protótipo vacinal ou BCG controles, mostrando um maior percentual de células positivas quando avaliados por citometria de fluxo. Contudo, mesmo com esta diferença observamos que o protótipo vacinal BCG/sm14 não alterou o perfil de expressão de IL-10, IL-12 e TNF-alfa. O fato do plasmídeo pAU5 ser um vetor de expressão citoplasmática, sugere que a proteína Sm14 não foi capaz de estimular a mudança de citocinas em monócitos humanos. Experimentos futuros, devem investigar o papel do BCG/sm14 em macrófagos maduros, quanto a indução de citocinas pró e anti-inflamatórias, TLR, bem como na indução da resposta imune adaptativa, como a apresentação antigênica, na tentativa de melhor entender a resposta imune a esta vacina candidata.