Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics

BACKGROUND Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is routinely used to detect viral infections. In Brazil, it is mandatory the use of nucleic acid tests to detect hepatitis C virus (HCV), hepatitis B virus and human immunodeficiency virus in blood banks because of the immunological window. The use of an internal control (IC) is necessary to differentiate the true negative results from those consequent from a failure in some step of the nucleic acid test. OBJECTIVES The aim of this study was the construction of virus-modified particles, based on MS2 bacteriophage, to be used as IC for the diagnosis of RNA viruses. METHODS The MS2 genome was cloned into the pET47b(+) plasmid, generating pET47b(+)-MS2. MS2-like particles were produced through the synthesis of MS2 RNA genome by T7 RNA polymerase. These particles were used as non-competitive IC in assays for RNA virus diagnostics. In addition, a competitive control for HCV diagnosis was developed by cloning a mutated HCV sequence into the MS2 replicase gene of pET47b(+)-MS2, which produces a non-propagating MS2 particle. The utility of MS2-like particles as IC was evaluated in a one-step format multiplex real-time RT-PCR for HCV detection. FINDINGS We demonstrated that both competitive and non-competitive IC could be successfully used to monitor the HCV amplification performance, including the extraction, reverse transcription, amplification and detection steps, without compromising the detection of samples with low target concentrations. In conclusion, MS2-like particles generated by this strategy proved to be useful IC for RNA virus diagnosis, with advantage that they are produced by a low cost protocol. An attractive feature of this system is that it allows the construction of a multicontrol by the insertion of sequences from more than one pathogen, increasing its applicability for diagnosing different RNA viruses.

Desenvolvimento e avaliação de métodos moleculares para o diagnóstico da dengue / Development and evaluation of molecular methods for the diagnosis of the dengue

A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem, constituindo um sério problema de saúde pública no mundo, especialmente em países tropicais onde as condições do meio ambiente favorecem a proliferação dos seus vetores, os mosquitos do gênero Aedes. Atualmente, quase metade da população mundial vive em áreas de risco para a doença e, apesar de sua extensão e gravidade, vacinas ou tratamentos específicos ainda não estão disponíveis. Tendo conhecimento da urgência na melhoria da vigilância epidemiológica da dengue e das deficiências do diagnóstico laboratorial dessa e de outras doenças no país, realizou-se esse trabalho cujo principal objetivo foi o desenvolvimento de métodos diagnósticos baseados em técnicas moleculares de última geração para a detecção e sorotipagem do vírus da dengue. As metodologias escolhidas foram as de PCR em tempo real e de microarranjo líquido, as quais representam os mais recentes avanços na área de diagnóstico molecular. Diferentes conjuntos de oligonucleotídeos sorotipo e grupo-específicos foram avaliados quanto a capacidade de amplificar e identificar os sorotipos DENV1, DENV2 e DENV3 pelos dois métodos. Dessa forma, desenvolveu-se, baseado na técnica de PCR em tempo real, três ensaios uniplex sorotipo-específicos para dengue e um teste grupo-específico capaz de amplificar todos os sorotipos do vírus. Para o ensaio baseado na técnica de microarranjo líquido os oligonucleotídeos, após testados individualmente, foram combinados em diferentes formatos multiplex, tanto na reação de amplificação (PCR) como na de hibridação. Diferentes protocolos de hibridação foram também avaliados. Quando testada contra curvas padrões obtidas a partir da diluição de quantidades conhecidas dos três sorotipos do vírus, a PCR em tempo real mostrou-se, para todos os ensaios, capaz de amplificar e detectar mesmo a menor quantidade de vírus avaliada, equivalente a 53,57 FFU/ml. Já a sensibilidade do teste de microarranjo líquido...