Relación estructura-función de la enzima uroporfirinógeno descarboxilasa: implicancias para la comprensión y el tratamiento de la porfiria cutánea tarda / Structure-function relationship of the enzyme uroporphyrinogen decarboxylase: implications for the understanding and treatment of porphyria cutanea tarda / Relação estrutura-função da enzima uroporfirinogênio descarbioxilase: implicações para a compreensão e tratamento da porfiria cutânea tardia / Reconocimiento a la trayectoria del Prof. Dr. Juan Miguel Castagnino†

Resumen La uroporfirinógeno descarboxilasa humana (UROD-h) es la quinta enzima del camino biosintético del hemo y su actividad deficiente, relacionada a mutaciones en su gen, se encuentra asociada a un subgrupo de porfirias. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación entre la dimerización de la enzima y su actividad enzimática y comprobar si la dimerización de UROD-h es imprescindible tanto para la primera etapa de la reacción (urogen→heptagen), como para la segunda etapa (heptagen→coprogen). Con ese objetivo, se expresó y purificó la UROD-h hasta homogeneidad, se analizó el comportamiento dímero-monómero bajo distintas condiciones que pudieran desplazar el equilibrio de dimerización y se evaluó la actividad enzimática en dichas condiciones. Los resultados obtenidos sugieren que la especie activa para la primera etapa de la reacción es el homodímero y que tanto el dímero como el monómero se comportan como especies activas para la segunda etapa de la reacción. Se propone que mutaciones clínicas como la Y311C, existentes en pacientes con porfiria cutánea tarda, podrían afectar la estabilidad del dímero y podrían ser el blanco para futuras terapias génicas.

Abstract Human uroporphyrinogen decarboxylase (UROD-h) is the fifth enzyme in the heme biosynthetic pathway and its deficient activity, related to mutations in its gene, is associated with a subset of porphyrias. The objective of this work was to study the relationship between the dimerisation of the enzyme and its enzymatic activity and to verify if the dimerisation of UROD-h is essential both for the first stage of the reaction (urogen→heptagen), and for the second stage (heptagen→ coprogen). With this objective, the UROD-h was expressed and purified to homogeneity, the dimer- monomer behaviour was analysed under different conditions, which could shift the dimerisation equilibrium, and the enzymatic activity was evaluated under these conditions. The results obtained suggest that the active species for the first stage of the reaction is the homodimer, and both the dimer and the monomer behaved as active species for the second stage of the reaction. It is proposed that clinical mutations such as Y311C, existing in porphyria cutanea tarda patients, could affect dimer stability and could be the target of future gene therapies.

Resumo A enzima uroporfirinogênio descarboxilase humana (UROD-h) é a quinta enzima da via biossintética do heme e sua atividade deficiente, relacionada com mutações em seu gene, está associada a um subgrupo de porfirias. O objetivo deste trabalho foi estudar a relação entre a dimerização da enzima e sua atividade enzimática e comprovar se a dimerização da UROD-h é imprescindível tanto para a primeira etapa da reação (urogênio→heptagênio), quanto para a segunda etapa (heptagênio→coprogênio). Com esse objetivo, a UROD-h foi expressa e purificada até a homogeneidade, o comportamento de dímero-monômero foi analisado sob diversas condições, que puderam deslocar o equilíbrio de dimerização, e a atividade enzimática foi avaliada em tais condições. Os resultados obtidos sugerem que a espécie ativa para a primeira etapa da reação é o homodímero, e tanto o dímero quanto o monômero se comportam como espécies ativas para a segunda etapa da reação. Propõe-se que mutações clínicas como Y311C, existentes em pacientes com porfiria cutânea tardia, poderiam afetar a estabilidade do dímero e poderiam ser o alvo de futuras terapias gênicas em porfiria cutânea tardia.

Estrés oxidativo en cefalópodos: I. Determinación de TBARS / Oxidative stress in cephalopods: I. TBARS determination

El estrés oxidativo se produce cuando se genera un desbalance desfavorable entre las especies reactivas del oxígeno y las defensas antioxidantes, provocando daño oxidativo a macromoléculas. Varios estudios han resaltado la importancia del estrés oxidativo en el campo de la ecotoxicología, particularmente su relación con el impacto que generan los contaminantes que alcanzan los cuerpos de agua. El cuantifcar los parámetros de estrés oxidativo ha permitido el uso de los mismos como herramienta de diagnóstico (biomarcadores), con capacidad predictiva del impacto de los contaminantes sobre los organismos. Uno de los índices más frecuentemente utilizados para estimar el daño oxidativo a lípidos es la determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), producto fnal de la peroxidación lipídica. Octopus tehuelchus es un importante recurso pesquero en la costa patagónica, expuesto en algunas áreas a contaminación antrópica. Dado que el estudio de parámetros de estrés oxidativo aún no ha sido abordado en esta Clase de moluscos y que en muchos modelos biológicos, los contaminantes ambientales actúan generando estrés oxidativo, es clave encontrar sus blancos de acción, para empezar a caracterizar las alteraciones metabólicas y fsiológicas asociadas a su mecanismo de acción. El objetivo de este trabajo fue la puesta a punto del método de determinación de daño oxidativo a lípidos en distintos tejidos del pulpo Octopus tehuelchus desde modelos previamente ensayados en el laboratorio.

Oxidative stress occurs when there is an unfavorable imbalance between reactive oxygen species and antioxidant defenses, causing oxidative damage to macromolecules. Several studies have highlighted the importance of oxidative stress in the ecology feld related to the impact generated by pollutants reaching water bodies. The quantifcation of oxidative stress parameters led to their use as diagnostic tools (biomarkers) with predictive capability of showing the impact of pollutants on organisms. One of the most frequently used indexes to estimate the oxidative damage to lipids is the determination of reactive thiobarbituric acid substances (TBARs) (fnal product of lipid peroxidation). Octopus tehuelchus is an important fshery resource in the Patagonian coast exposed to anthropogenic pollution. The study of oxidative stress parameters has not been yet tackled in this class of molluscs. Taking into account that, in many biological models, environmental pollutants generate oxidative stress, it is important to fnd their targets of action, to start to characterize metabolic and physiological alterations associated to their mechanisms of action. The aim of this work was to adjust the method of determination of oxidative damage to lipids in various tissues of the octopus, Octopus tehuelchus, from models previously tested in the laboratory.

Porphyrinogen carboxylyase. Studies on existence of isoenzymes

Porphyrinogen carboxylyase from normal rat liver was subjected to purification methods. Two different purification protocols were used. In both cases, the inital steps consisted in obtaining a liver homogenate, followed by centrifugation, salt precipitation and phosphate gel absorption. Scheme I consisted in then submiting the preparation to DEAE-cellulose, followed by Sephacryl S-200 and Phenyl-sepharose sequential column chromatographies. Scheme II involved an affinity column followed by a Sephadex G-75 gel filtration column. In both cases, the enzyme was stored at-20 degrees Celsius until its assay. The addition of 2mM dithiotreytol to the incubation media or to the enzyme extract before storage, did not help improve the activity nor the stability of the enzyme. Those fractions containing the maximal enzyme activity, detected using Uroporphyrinogen III or Pentacarboxy-porphyrinogen III as substrate, were not alawys present in the same tubes for the different columns employed. In addition, the degree of purification obtained in some steps was different according to the substrate employed. The results suggest the existence of at least two isoenzymes for rat liver porphyrinogen carboxy-lyase.

Uroporfirinógeno decarboxilase eritrocitaria: un método de detección de la porfiria cutánea tarda familiar latente / Uroporphyrinogen decarboxylase eritrocyte: detection method of the porphyria cutanea tarda familiar latent

Se determinaron los niveles de porfirinas y precursores en orina y la actividad uroporfirinógeno decarboxilasa (URO-D) en eritrocitos de 13 miembros de una familia. Los datos de actividad enzimática y de excreción de porfirinas mostraron que el defecto genético de la porfiria cutánea tarda (PCT) proviene del abuelo. En 9 de los casos analizados, que incluyen niños de 3 a 10 años, la actividad URO-D se hallaba disminuida alrededor de un 50 por ciento. Estos enfermos presentaron cuadros clínicos y de laboratorio diferentes: 5 paciente tuvieron manifestaciones cutáneas y excreción urinaria aumentada de porfirinas, principalmente uro y heptacarboxiporfirinas (PCT manifiesta); familiar presentó incremento de la eliminación de porfirinas por orina, sin alteraciones cutáneas (PCT subclínica) y en los tres restantes, el examen clínico y el perfil urinário de porfirinas fueron normales (PCT latente). Se discuten los factores capaces de desencadenar la manifestación de la enfermedad y se remarca el valor diagnostico de la determinación de la actividad URO-D eritrocitaria para la detección de los casos latentes