RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE mARN DE LAS METALOPROTEINASAS 2 Y 9 Y EL INHIBIDOR TIMP-1 EN MOLA HIDATIDIFORME COMPLETA / RELATIONSHIP BETWEEN METALLOPROTEINASES 2 AND 9 AND TIMP-1 INHIBITOR mRNA EXPRESSION IN HYDATIDIFORME MOLE / RELAÇÃO DA EXPRESSÃO DE mRNA DAS METALOPROTEINASAS 2 E 9 E DO INHIBIDOR TIMP-1 NA MOLA HIDATIDIFORME COMPLETA

Durante el comienzo de la gestación el factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II) se expresa abundantemente en la placenta y podría regular el comportamiento invasivo de las células trofoblásticas. La habilidad invasiva dependerá también de la capacidad de secretar metaloproteinasas (MMPs), cuya expresión anormal contribuye a varios procesos patológicos. En la Enfermedad Trofoblástica Gestacional (ETG) estos factores podrían estar desregulados, así la mola hidatidiforme completa (MHC) conduce a la formación del coriocarcinoma, que es un tumor invasivo y metastásico. El objetivo de este estudio fue investigar la relación entre los niveles de mARN de IGF-II, MMP-2, MMP-9 y TIMP-1, por la técnica de RT-PCR, en tejidos de mola hidatidiforme vs. placentas de primer trimestre. La actividad de las MMPs se evaluó usando el ensayo de zimografía, encontrando que en MHC ésta se incrementa, lo cual podría relacionar la malignización del trofoblasto con el incremento en su capacidad invasiva. La expresión elevada de IGF-II en esta patología, también podría estar asociada con el incremento en la actividad de estas MMPs. Una mayor relación entre la expresión de mARNde MMP-9/TIMP-1 en la mola hidatidiforme completa se sugiere como predictor de malignización del tejido trofoblástico .

At the beginning of gestation the Insulin Like Growth Factor II (IGF-II) is highly expressed in placenta and it could regulate the invasive behavior of trophoblastic cells. This invasive ability depends on its capability to secret metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs), abnormal expression of which could contribute to several pathological processes.In the Gestational Trophoblastic Diseases (GTD) these factors could be unregulated, in this way complete hydatidiforme mole (CHM) produces the choriocarcinoma which is an invasive and metastasic tumor. The aim of this study was to investigate the relationship between IGF-II, MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 mRNA levels by RT-PCR technique, in hydatidiform mole tissues vs. first normal trimester placentas. MMPs activity was evaluated using zimography assay finding that in CHM this is increased, which could relate trophoblast malignization with an increased invasive capability. The higher IGF-II mRNA expression in this pathology could, also, be associated with increased MMPs activity. A higher MMP-9/ TIMP-1 mRNA expression ratio in CHM is suggested as a predictor of trophoblastic tissue malignization .

No início da gestação o fator de crescimento semelhante à insulina tipo II (IGF-II) é altamente expresso na placenta e poderia regular o comportamento invasivo das células trofoblásticas. Esta habilidade invasiva também depende da sua capacidade de produzir metaloproteinasas (MMP) e inibidores das mesmas (TIMP), expressão anormal da qual poderia contribuir em vários processos patológicos. Nas Doenças Trofoblásticas da Gestação (Gestational Trophoblastic Disease, ETG) estes fatores poderiam ser desregulados; deste modo a Mola Hidatidiforme Completa (MHC) produz coriocarcinoma que é um tumor invasivo e metastásico. O objetivo deste estudo era pesquisar a relação entre os níveis de mRNA do IGF-II, MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, através da técnica de RT-PCR em tecidoos da MHC vs. placenta do primeiro semestre. Atividade das MMP foram avaliadas pelo ensaio de zimografia achando que em MHC aumenta; isto poderia relacionar o incremento do malignidade do trofoblasto com uma capacidade invasiva aumentada. A expressão mais alta do IGF-II nesta patologia pode também estar associada com atividade aumentada destas MMP. Uma relação aumentada da expressão do mRNA de MMP-9/TIMP-1 na MHC é sugerida como um preditor do incremento da malignidade do tecido trofoblástico .

Obtención de una sonda específica para evaluar la transcripción del gen STAT5b / Obtaining a specific probe to evaluate STAT5b gene transcription

Se describe la estrategia empleada para clonar, en un vector de expresión, un fragmento de 306 pb del gen de STAT5b de rata, amplificado por la técnica de RT-PCR. Se amplificó una región en el terminal 3' donde se encuentra la mayor diferencia entre las secuencias del cADN de las isoformas STAT5a y STAT5b de rata. La clonación se logró utilizando el nuevo sistema TOPO-TA recomendado para productos de difícil clonación. El fragmento se subclonó en el vector pBlueScrip II SK y se caracterizó mediante secuenciación y análisis de restricción. La subclonación se realizó con el propósito de poder obtener sondas sentido y antisentido de ARN por transcripción in vitro. Esta sonda específica se empleó para cuantificar niveles de mARN de STAT5b en hígado de ratas macho mediante la técnica de hibridización en solución o ensayo de proteción de ARNasas

Purificación y caracterización electroforética de la proteína de unión a GH (GHBP) en suero humano y de pacientes con cáncer y en embarazo: evidencia de la exitencia de una proteína de unión a prolactina (PRLBP) / Purification and electrophoretic characterization of growth hormone binding protein (GHBP) in human, cancer and pregnancy sera: evidence of the presense of prolactin binding protein (PRLBP)

Una de las formas de regulación de la actividad de ciertas citocinas es la generación de formas solubles del receptor, las cuales actúan principalmente como proteínas de unión, aunque también se les han atribuido funciones de carácter agonista. El objetivo de este trabajo fue el de establecer la presencia de proteínas de unión a hormona de crecimiento (GHBP) y prolactina (PRLBP) en suero humano. La GHBP se purificó parcialmente mediante un nuevo método empleando hormona humana de crecimiento (GH, growth hormone) humana inmovilizada sobre Sepharosa y su separación y detección se realizó por medio de electroforesis e inmunotransferencia (Western blot), utilizando un anticuerpo dirigido contra el receptor de GH. Los resultados mostraron que la GHBP de suero humano es una mezcla compleja de proteínas con pesos en el rango de 27 a 62 kDa, relacionadas estructuralmente con el receptor de GH y cuyo origen está por determinarse. El suero proveniente de pacientes con cáncer de seno en estados 3 y 4, así como el de embarazo, mostró el mismo perfil de proteínas aunque sus niveles fueron en todos los casos inferiores a la normalidad, siendo los más bajos los de embarazo. En cuanto a la PRLBP, mediante anticuerpos antirreceptor, se identificó una proteína sérica de 150 kDa disociable en dos subunidades de pesos 50 y 30 kDa, consiste con lo informado por otros autores. De acuerdo con el peso establecido y a su incapacidad para unir hGh, se concluyó que no es una forma soluble del receptor y se sugiere que puede ser un anticuerpo antiidiotípico presente en el suero humano. No se encontraron diferencias en el perfil ni el contenido de las PRLBP en los tres tipos de suero analizados. Los resultados obtenidos ponen en evidencia la exitencia de una proteína de unión a prolactina relacionada con el receptor de PRL y cuyo origen en humanos está por establecerse

Producción de la proteína recombinante JAK2 de ratón / Production of mouse recombinant JAK2 protein

El presente trabajo describe la producción de la proteína recombinante JAK2, empleando un sistema de vectores de expresión baculovirales. La infección de células Sf9, derivadas del tejido de ovario de Spodoptera frugiperda, permitió establecer las condiciones óptimas de dilución del virus en 10 µl/ml de medio y de tiempo de recolección en 72 horas post-infección. Se recolectaron y ultrafiltraron extractos correspondientes a la infección de 5 x 10 a la 7 células, aproximadamente, y se sometieron a cromatografía de intercambio iónico (DEAE-Sephacel), lográndose purificar parcialmente la proteína JAK2 por medio de un gradiente continuo de fuerza iónica (NaCl 10-500 mM). La presencia de JAK2 se verificó por Western blot, empleando un anticuerpo policlonal producido en conejo contra los residuos 758-776 de JAK2 de ratón. Los resultados indicaron que la proteína obtenida por este sistema de expresión se sintetiza en forma fosforilada/activada

Identificación de las principales proteínas de unión a IGF (IGFP) en tejidos de rata normal / Identification of the main IGF binding protein (IGFBPs) in normal rat tissue

En este trabajo se investigó la presencia de las principales proteínas de unión a IGF-I en tejidos de rata y el tamaño de los complejos formados en cada caso. Mediante análisis de Western ligand blot (WLB) y cromatografía de exclusión molecular, se separaron e identificaron cuatro proteínas de unión, correspondientes a las IGFBP-1 a IGFBP-4. En todos los tejidos analizados, se detectó la proteína IGFBP-3, aunque su concentración varió con el tipo de órgano, siendo muy abundante en hígado, riñon y corazón y escasa en órganos linfoides (timo y bazo). IGFBP-1 e IGFBP-2 se identificaron en hígado y pulmón y, además, en corazón y músculo esquelético, órganos donde hasta el momento no se han identificado los correspondientes mARN, como tampoco IGFBP-4, identificada en este trabajo en pulmón. En conclusión, los resultados obtenidos indican un perfil típico para las IGFBP de acuerdo con el tejido, aunque no es claro aún si su presencia es el resultado de su síntesis in situ o de un transporte transcapilar. La identificación de sus mensajeros es un paso esencial para comprender el papel regulador que estas proteínas desempeñan en la biodisponibilidad del IGF-I en los diferentes tejidos

Obtención de una sonda para cuantificar el mARN del factor activador de la transcripción STAT5 en rata / A new probe for use in quantifying STAT5 transcription activator factor in rat mRNA

Se describe la estrategia empleada para clonar, en un vector de expresión, un fragmento del gen de STAT5 amplificado por la técnica de PCR. Variando la concentración de magnesio y la temperatura de alineación, se logró amplificar el fragmento deseado a partir de un cADN de sTAT5b de ratón. El producto de PCR se clonó y se comprobó la identidad de la sonda mediante análisis de restricción y secuenciación. Esta sonda se usó en el ensayo de protección con ribonucleasa A o hibridización en solución, para cuantificar el mARN de STAT5 en hígado y linfocitos de timo de ratas hembras. Se encontró una mayor expresión del mARN de STAT5 en hígado

Cuantificación del factor de crecimiento similar a la insulina (IG-I) total en tejidos de rata / Quantification of total insulin-like growth factor (IGF-I) in rat tissues

Se establecieron los contenidos totales de IGF-I en algunos tejidos de rata adulta normal (hígado, riñón, corazón, pulmón, timo, bazo y músculo esquelético) por medio de radioinmunoanálisis (RIA) específico. La efectividad de la extracción ácido-etanólica (AE), corrientemente empleada para eliminar la interferencia de las proteínas de unión del IGF-1 (IGFBPs) en el análisis del factor en suero, se evaluó para las muestras de tejidos y se comparó con la extracción AE seguida de crioprecipitación (AEC). Los resultados mostraron que la extracción AE no permite remover completamente las IGFBPs y que con el paso adicional de crioprecipitación se libera aproximadamente 20 por ciento más de IGF-1 de los tejidos. Finalmente, por medio de RIA se estableció la distribución tisular de este factor de crecimiento en rata. El método aquí descrito puede aplicarse en estudios de regulación metabólica o nutricional del IGF-1