Apoptogenic effect of the lipophilic o-naphthoquinone CG 10-248 on rat hepatocytes: light and electron microscopy studies

CG 10-248 (3,4-dihydro-2,2-dimethyl-9-chloro-2H-naphtho[1,2b]pyran-5,6-dione; CG-NQ), a beta-lapachone analogue, modified the ultrastructure of rat hepatocytes, as demonstrated by light and electron microscopy. After 4 h incubation with 100 microM CG-NQ, the following effects were observed: (a) nuclear chromatin condensation; (b) chromatin fragmentation; (c) displacement of mitochondria, concentrated around the nucleus; (d) disruption or expansion of mitochondrial outer or inner membranes, respectively; (e) displacement and alteration of endoplasmic reticulum (rough and smooth); (f) decrease of microvilli; (g) blebbing of plasma membrane and production of apoptotic bodies formed by folding of plasma membrane fragments around mitochondria or peroxysomes; and (h) production of hydrogen peroxide. Expression of such effects varied according to hepatocyte samples and taken together strongly support an apoptotic action of CG-NQ dependent on reactive oxygen species.

Acción inhibitoria de sistemas Fenton sobre la topoisomerasa I de Trypanosoma cruzi y Crithidia fasciculata / Effect of Fenton systems on Trypanosoma cruzi and Crithidia fasciculata topoisomerase I

Los sistemas Fenton (H2O2/Fe o H2O2/Cu) fueron capaces de inhibir la actividad topoisomerasa I de extractos crudos de Trypanosoma cruzi y Crithidia fasciculata. El agregado de compuestos de tioles o complejantes de metales, modificó la inhibición y dicho efecto dependió del metal y del origen de la enzima. El glutation reducido, DL-ditiotreitol, y N-aceti-L-cisteína 1 mM fueron efectivos protectores frente a la inhibición, inducida por el sistema H2O2/Fe, de la actividad presente en T.cruzi, el manitol protegió 37 por ciento, mientras que la histidina y etanol fueron inefectivos. Con la topoisomerasa de C.fasciculata, glutatión reducido, DL-ditiotreitol y N-acetil L-cisteína protegieron 100 por ciento a la enzima de la acción deletérea del sistema Fenton (Fe), los compuestos manitol, histidina y cisteína 1 mM protegieron 48, 34 y 28 por ciento, respectivamente, mientras que el etanol 4 mM fue inefectivo. Con el sistema H2O2/Cu y la enzima de T.cruzi, el DL-ditiotreitol y la histidina 1mM protegieron 100 y 60 por ciento, respectivamente, los otros protectores ensayados fueron menos efectivos. Resultados semejantes se obtuvieron con la topoisomerasa de C.fasciculata. La disminución por sistemas Fenton de la actividad topoisomerasa I de los extractos resultó no ser revertida por posterior incubación con los compuestos que tuvieron efecto protector. Se sugiere que la estructura molecular de la proteína podría actuar como secuestrante de radicales libres generados por los sismtemas Fenton o mediante la unión de metales como el Cu o Fe, facilitando la generación de los mismos in situ. Ambos mecanismos conducirían a la inactivación de la misma.

Myeloperoxidase-generated phenothiazine cation radicals inactivate Trypanosoma cruzi dihydrolipoamide dehydrogenase

Peroxidase/H2O2/phenothiazine systems irreversibly inhibit Trypanosoma cruzi dihydrolipoamide dehydrogenase (LADH). Inactivation of the parasite enzyme depended on (a) phenothiazine structure; (b) peroxidase nature; (c) incubation time and (d) the presence of a cation radical scavenger. With the myeloperoxidase/H2O2/system, promazine, trimeprazine, thioridazine, promethiazine, prochlorperazine, chlorpromazine and perphenazine were the most effective derivatives out of twelve phenothiazines studied. An electronegative substituent at position 2 of the phenothiazine ring such as Cl, or trifluoromethyl, propionyl and nitrile groups decreased or nullified phenothiazine activity. Myeloperoxidase/H2O2/, horseradish peroxidase/H2O2/, and myoglobin/H2O2/systems activated phenothiazines producing the corresponding cation radicals, myeloperoxidase being the most selective one with respect to phenothiazine structure. The myoglobin/H2O2/system activated phenothiazines that were scarcely active or inactivate with the MPO/H2O2/system, such as the trifluoromethyl derivatives. Production of phenothiazine cation radicals was demonstrated by optical spectroscopy. Phenothiazine cation radical stability depended on their structure as illustrated by promazine and thioridazine. Thiol compounds (GSH, N-acetyl-cysteine and penicillamine), aromatic aminoacids (L-tyrosine, L-tryptophan, and the corresponding peptides) and ascorbate scavenged phenothiazine cation radicals, thus preventing LADH inactivation. Comparison of the summarized phenothiazine effects with those of phenothiazines on T. cruzi suggest the role of cation radicals in phenothiazines chemotherapeutic actions.

Inactivación de la tripanotiona reductasa de Trypanosoma cruzi por radicales libres catiónicos de fenotiazinas / Inactivation of Trypanosoma cruzi trypanothione reductase by phenothiazine cationic free radicals

Peroxidase/H2O2/phenothiazine systems produced irreversible inhibition (inactivation) of Trypanosoma cruzi trypanothione reductase (TR). The enzyme inactivation depended on (a) the incubation time of TR with the peroxidase/H2O2/phenothiazine system; (b) the peroxidase nature and (c) the phenothiazine structure. With the more effective peroxidase/H2O2/phenothiazine systems, TR inactivation kinetics presented a relatively fast initial phase, lasting for about 10 min, in which most of the enzyme activity disappeared. This phase was followed by a slower one and, after 30 min incubation, TR was totally inactivated. Three peroxidases were assayed as catalysts of TR inactivation: the horseradish peroxidase (HRP), leukocyte myeloperoxidase (MPO) and modified myoglobin (Mb). Under comparable experimental conditions, the peroxidase system activity decreased in the given order. With HRP systems, 10 microM Thioridazine (TRDZ), Promazine (PZ), Trimeprazine (TMPZ), Prochlorperazine (PCZ), Propionylpromazine (PPZ), Chlorpromazine (CPZ) and Perphenazine (PFZ), produced 95-100 inactivation of TR. With the MPO/H2O2 systems, PZ. TRDZ and TMPZ were the most effective. Under similar experimental condition, the Mb/H2O2/PZ,/TMPZ, /TRDZ and CPZ systems effectively inactivated TR. The presence of alkylamino, piperazinyl, or piperidinyl groups in PTZ N atom (position 10) and -Cl, -CF3, -SCH3, COCH2CH3 and -CN in position C2 exerted significant influence on phenothiazine activity. Glutathione (GSH) prevented TR inactivation by the HRP/H2O2/PZ and MPO/H2O2/PZ systems. The HRP/H2O2 and MPO/H2O2/phenothiazines systems generated the corresponding cationic radicals (FTZ.+) the stability of which was limited by their conversion into phenothiazine-sulfoxides (PTZ-SO). The latter ones were inactive on TR. GSH rapidly reacted with PTZ+.; thus producing cation radical detoxication. These reactions fit in well with GSH protection of TR against the peroxidase/H2O2/phenothiazine system, as well as with the FTZ.+ role in phenothiazine cytotoxicity.

Inactivation of Trypanosoma cruzi dihydrolipoamide dehydrogenase by leukocyte myeloperoxidase systems: role of hypochloride and nitrite related radicals

Dihydrolipoamide dehydrogenase (LADH) from Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas' disease, was inactivated by treatment with myeloperoxidase (MPO)-dependent systems. LADH lipoamide reductase and diaphorase activities decreased as a function of incubation time and composition of the MPO/H2O2/halide system, a transient increase preceding the loss of diaphorase activity. Iodide, bromide, thiocyanide and chloride were effective components of MPO/H2O2 or MPO/NADH systems. Catalase prevented LADH inactivation by the MPO/NADH/halide systems in agreement with H2O2 production by NADH-supplemented LADH. Thiol compounds (L-cysteine, N-acetylcysteine, penicillamine, N-(2-mercaptopropionylglycine) and Captopril prevented LADH inactivation by the MPO/H2O2/NaCl system and by NaOCl, thus supporting HOCl as agent of the MPO/H2O2/NaCl system. MPO/H2O2/NaNO2 and MPO/NADH/NaNO2 inactivated LADH, the reaction being prevented by MPO inhibitors and thiol compounds. T. cruzi LADH was affected by MPO-dependent systems like myocardial LADH, allowance being made for the variation of the diaphorase activity and the greater sensitivity of the T. cruzi enzyme to MPO/H2O2/halide systems.

Inhibición de la oxidación fosforilante en Crithidia fasciculata y Trypanosoma cruzi por o-quinonas lipofílicas y nifurtimox / [Inhibition of oxidative phosphorylation in Crithidia fasciculata and Trypanosoma cruzi by lipophilic o-quinones and nifurtimox]

ATP and ADP levels were determined in Crithidia fasciculata and Trypanosoma cruzi. The nucleotide levels in crithidia or epimastigotes at the stationary phase of growth were, in nmol/10(8) cells, 15-40, and 3-7, for ATP and ADP, respectively. Incubation with the lipophilic o-naphthoquinones CG 8-935, CG 9-442 and CG 10-248 or the anti-chagasic nitrofuran nifurtimox, significantly decreased ATP level, with non-significant variations of the ADP level. The kinetics of ATP variation showed an initial 1-2 h lag and the diminution of the ATP level reached maximum value after 4-6 h incubation. Addition of L-glutamate or D-glucose as energy sources produced 2- or 3-fold increase of ATP level, after incubation the protozoa for 4-6 h with the corresponding substrates. Quinones and nifurtimox strongly depressed D-glucose or L-glutamate effects. Buthionine sulfoximine an inhibitor of glutathione biosynthesis, enhanced the effect of nifurtimox on ATP level in Crithidia fasciculata. It is concluded that by inhibiting ATP synthesis, either directly or-through oxygen radicals, the assayed drugs produced their cytotoxic action.

Inactivacion de la dihidrolipoamida deshidrogenasa de miocardio por Cu(II) y peroxido de hidrogeno / Inactivation of myocardial dihydrolipoamide dehydrogenase by Cu(II) and hydrogen peroxide

Se estudió la inactivación de la dihidrolipoamida deshidrogenasa de corazón porcino (LipDH) por oxi-radicales, generados por Cu(II) suplementado o no con H2O2 (sistema SF-CU(II) o ácido ascórbico (sistema Cu(II)-Asc). As concentraciones utilizadas fueron: 2,5-10 µM Cu(II): 3,0 mM H2O2 y 0,5 mM ascorbato. Después de 5 minutos de incubación, la actividad lipoamida reductasa de la LipDH decayó de manera irrevedrsible: 83-98 por ciento con SF-Cu(II) y Cu(II)-Asc o 46-53 por ciento con Cu(II). La actividad diaforasa aumentó, demostrando un daño localizado de los grupos SH de la LipDH. NAD+, dihidrolipoamida, GSSG, CAPTOPRIL, complejantes de CU(II) (DL-histidina, batocuproína, EDTA y DETAPAG), la tripanotiona y el alopurinol, protegieron la LipDH frente al SF-Cu(II). El GSH, el ditiotretol, la N-acetilcisteína, la mercaptopropionilglicina, la DL-penicilamina y la L-cisteína, protegieron LipDH frente al CU(II) solamente. NADH, ADP (no ATP), OH-DOPAMINA, DOPA, DOPAC y catecol, aumentaron la inactivación de LipDH por el SF-Cu(II) mientras que OH-DOPAMINA aumentó el efecto del Cu(II). Se discute la acción de los oxi-radicales generados por Cu(II), como causa del daño miocárdico por la reoxigenación post-isquemia

Diabetes y transporte de calcio en mitocondrias hepaticas / Diabetes and calcium transportation in liver mitochondria

Se aislaron las mitocondrias hepáticas de ratas normales y ratas con diabetes crónica por inyección de estreptozotocina. Se determinó su capacidad de captar Ca2+ en un medio isotónico, con succinato como fuente de energía y Antipirilazo III como indicador de [Ca2+]. Se comprobó que la velocidad de captación fue significativamente menor en las mitocondrias diabéticas. La inhibivión con Ruthenium Red permitió medir la velocidad de eflujo del Ca2+, que resultó significativamente mayor que en las mitocondrias normales. La medida del potencial de membrana con safranina como indicador dio un valor significativamente menor en las mitocondrias diabéticas, en concordancia con la disminución de la captación de Ca2+

Efecto de quinonas y nitrofuranos sobre Trypanosoma mega y Crithidia fasciculata / Effect of quinones and nitrofurans on Trypanosoma mega and Crithidia fasciculata

La valoración in vitro de tripanocidas activos sobre Trypanosoma cruzi es el primer paso para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos contra la enfermedad de Chagas. Para verificar si una información equivalente puede lograrse con organismos no patógenos, se estudió la acción de varios tripanocidas de t. cruzi sobre T. mega y Crithidia fasciculada. Las drogas se ensayaron sobre el crecimiento de los protozoarios que se midió por la turbiedad de la suspensión celular en medio de cultivo líquido. Una serie de quinonas, incluyendo quinonas lipofílicas, lapachonas, quinina-iminas, benzoquinonas, un quinol (miconidina) y nitrofuranos (nifurtimox y análogos derivados del grupo (5-nitro-2-furfurilideno)-amino (grupo NF) inhibieron el crecimiento de los organismos, especialmente el de T. mega, con I50 menores de 5 micronM, para los compuestos mas activos. La sensibilidad de T. mega fue similar a la de T. cruzi y significativamente mayor que la de C. fasciculata. El cultivo de muestras de T. mega, preincubados con las mismas drogas,d emostró efectos irreversibles con los NF-derivados del pirazol, imidazol, indazol y benzimidazol pero no con el nifurtimox. En iguales condiciones, C. fasciculata fue afectada solamente por la ß-lapachona y una naftoquinona-imina. Estos resultados califican a T. mega como un modelo adecuado para el ensayo inicial de quimioterápicos anti-chagásicos, como lo son C. fasciculata y T. brucei para los tripanosomas africanos

Inhibición de la glutation reductasa por nifurtimox y otros derivados del 5-nitrofurano / Glutathione reductase inhibition by nifurtimox and related nitrofurans

Derivados del 5-nitrofurano portadores de heterociclos nitrogenados insaturados inhibieron la GR de hígado, corazón y riñoz de rata, con mayor eficiencia que portadores de hetereciclos saturados o de grupos de estructura acíclica , como el nifurtimox, la nitrofurazona y el ácido 5 nitro-2-furoico. La inhibición muestra cinética acompetitiva respecto a los sustratos NADPH y GSSG y no implica un ciclo redox del grupo nitro o diversión de electrones al oxígeno, con formación de oxi-radicales. Ell 2-nitroimidazol y su derivado el benznidazolm el 5-nitroindol y el cloranfenicol (derivado del nitrobencilo), no inhibieron la GR. La GP, enzima asociada fisiológicamente a la GR para la desintoxicación de hidroperóxidos no fue inhibida por los nitrofuranos activos sobre la GR, cuando la disponibilidad de GSH fue suficiente para la actividad de la GP. Cuando la actividad de la GR fue limitante de la concentración de GSH, la actividad GP del sistema fue inhibida

Sinthetic trypanocides: growth-inhibiting properties of new 1, 2, 3, 4 - tetrahydrocarbazoles on Trypanosoma cruzi

Se sintetizaron varios nuevos derivados del 1,2,3,4, tetrahidrocarbazol, 5,6-dihidrobenzo (alfa) carbazol, 3-metilindol y benzimidazol, que se ensayaron sobre cultivos del Trypanosoma cruzi, en el medio líquido de Warren. El 6-cloro-y el 6,8 dicloro-N-(1-etil-N-dimetilamino) 1,2,3,4, tetrahidrocarbazol fumarato resultaron los más potentes inhibidores del crecimiento del parásito. Estos carbazoles fueron relativamente más activos que los preparados previamente por Poliakoff y col

Inhibición de la lipoperaxidación en microsomas de hígado por nifurtimox y nitrofurantoina / Inhibition of lipoperoxidation in liver microsomes by nifurtimox and nitrofurantoin

El nifurtimox y la nitrofurantoína, dos nitrofuranos, inhibieron la formación de malondialdehído (MDA) por microsomas de hígado de rata incubados durante una hora con un sistema generador de NADPH (NADP+, glucosa-6-P, glucosa-6-P deshidrogenasa y Cl2 Mg), ADP y Fe**3+. Las drogas ensayadas se disolvieron en dimetilformamida previo a su agregado al medio de incubación. El efecto del nifurtimox se manifestó en función del tiempo de incubación, de la concentración de droga y disminuyó significativamente cuando se omitió la adición de ADP-Fe**3+. Al tiempo de inhibir la formación de MDA, el nifurtimox inhibió la destrucción de los ácidos grasos polietilénicos microsomales. Este efecto se expresó por las variaciones de la relación araquidónico/oleico, docosahexanoico/oleico y el índice de dobles ligaduras. El nifurtimox inhibió también la destrucción del citocromo P-450, correlacionada con la lipoperoxidación. El solvente utilizado como vehículo del nifurtimox fue crítico para la inhibición, pues con DMSO el nifurtimox estimuló la formación de MDA, no así con DMFA, el solvente que se utilizó en los experimentos descriptos. Con los sistemas peroxidantes ascorbato-Fe e hidroperóxido de t-butilo-Fe, que inducen la lipoperoxidación sin involucrar la NADPH-citocromo P-450 reductasa, el efecto inhibidor del nifurtimox fue relativamente menor comparado con la inhibición observada con el sistema NADPH-Fe. En esa forma, los resultados con ascorbato-Fe y peróxido de t-butilo-Fe indican inhibición de la iniciación de la lipoperoxidación. Sin embargo, cuando se agregó NADPH en concentración catalítica, la inhibición de la lipoperoxidación inducida por el hidroperóxido de t-butilo-Fe aumentó significativamente, sugiriendo la...

Menor oxidación de cuerpos cetónicos por mitocondrias de corazón en la diabetes / Decreased oxidation of ketone bodies in heart mitochondrias in diabetes

Ratas diabéticas por inyección de estreptozotocina presentaron concentraciones de 3-hidroxibutirato y acetoacetato en sangre 4,2 y 1,7 veces superiores a las normales, respectivamente. Al mismo tiempo, en las mitocondrias de corazón disminuyó la actividad de las enzimas iniciadoras del metabolismo oxidativo de esos cuerpos cetónicos, a saber, la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa (72%) y la succinil-CoA: acetoacetil-CoA (3 - oxoácido - CoA) transferasa (50%). En cambio, la acetoacetil-CoA tiolasa, no varió. La oxidación del 3-hidroxibutirato y el acetoacetato por las mitocondrias enteras de ratas diabéticas, suplementadas con ADP (en estado metabólico "3") disminuyó 42 y 48%, respectivamente, en relación a los testigos normales, no así la oxidación del piruvato o del L-glutamato más L-malato que no varió significativamente. Estas observaciones implican una modificación selectiva de las enzimas correspondientes a los cuerpos cetónicos. La composición lipídica y la depolarización de la fluorescencia del difenil hexatrieno en las mitocondrias diabéticas no presentaron diferencias respecto a las normales, de manera que las variaciones enzimáticas descriptas se pueden atribuir a una síntesis defectuosa de las proteínas mitocondriales

Efectos del nifurtimox, benznidazol y beta-lapachona sobre el metabolismo del ADN, ARN y proteínas en Trypanosoma cruzi / [Effects of nifurtimox, benznidazole, and beta-lapachone on the metabolism of DNA, RNA and proteins in Trypanosoma cruzi]

Nifurtimox and benznidazole have trypanostatic actions in vitro and inhibit the incorporation of [3H] thymidine, [3H] uridine and L-[3H] leucine in T. cruzi macromolecules. The effect of nifurtimox may be explained by (a) direct inhibition of nucleic acid biosynthesis, or (b) generation of the oxygen radicals in T. cruzi and therefore, only mechanism (a) should be valid. In order to obtain more information on the action of these drugs on T. cruzi, in the present study we examined the effect of nifurtimox and benznidazole on DNA, RNA and protein turnover in epimastigote (culture) forms of the parasite. Complementary experiments were performed with beta-lapachone that, like nifurtimox, generates oxygen radicals in T. cruzi. Epimastigotes (Tulahuen strain) at the exponential-phase of growth were cultured with [3H] thymidine, [3H] uridine or L-[3H] leucine to label DNA, RNA and protein, respectively. After incubation, the cells were washed free of radioactive precursor, resuspended in fresh medium and reincubated at 30 degrees C with nifurtimox (10 or 100 microM), benznidazole (38 or 380 microM) or beta-lapachone (1.6 or 7.8 microM), for 1-3 hours. Controls were incubated without drug. At one hour time intervals, sampler were taken, washed free of medium and filtered through 0.45 microns Metricel filters. The filters were washed with 10

trichloroacetic acid to remove the acid soluble material, and after drying, the radioactivity incorporated in DNA, RNA and protein was counted with a scintillation counter. The results show that after elimination of the labelled precursors, 3H activity in DNA, RNA and protein decayed as a function of the time of incubation. Nifurtimox, benznidazole and beta-lapachone, stimulated in all cases they decay of the incorporated radioactivity. Calculation of [quot ]half-life[quot ] values for DNA, RNA and protein(s) indicated that nifurtimox and beta-lapachone exerted their greatest effects on DNA while benznidazole increased the decay of DNA, RNA and protein to about the same extent. Taking into account the effects of nifurtimox and beta-lapachone on DNA stability, specific lesions (single-strand breaks) were investigated in DNA from control, nifurtimox, benznidazole or beta-lapachone treated epimastigotes. The number of single-strand breaks was (per 10(6)b) 25 with 100 microM nifurtimox, 1.4 with 380 microM benznidazole and 45 with 7.8 microM g-lapachone. Interestingly enough, after reincubation of nifurtimox-damaged epimastigotes in fresh medium for 24 hours, recovery of DNA lesions could be observed.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)