Caracterización espectroscópica del D-003 obtenido de la cera de caña de azúcar (Saccharum officinarum L. ) / Spectroscopic characterization of D-003 obtained from the sugar cane (Saccharum officinarum L. ) wax

Introducción: el D-003 es un ingrediente farmacéutico activo purificado a partir de la cera de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) con efectos como reductor del colesterol y antioxidante, el cual está compuesto por una mezcla de ácidos grasos libres saturados de elevado peso molecular, cada uno dentro de un intervalo de concentración específica determinada por cromatografía de gases (CG). La caracterización espectroscópica del D-003, sin embargo, no ha sido previamente informada. Objetivo: caracterizar el ingrediente farmacéutico activo nombrado D-003 de acuerdo con sus espectros ultravioleta (UV), infrarrojo (FTIR), resonancia magnética nuclear (RMN) y de masas (EM). Métodos: se evaluaron muestras de seis lotes de D-003 (CNIC, Cuba) mediante las técnicas de UV, FTIR, RMN-¹H, RMN-13C y CG-EM. Para obtener los espectros de masas de los ácidos del D-003, estos se derivaron como ésteres metílicos y trimetilsilil. La cuantificación de los ácidos grasos libres saturados de elevado peso molecular, analizados como ésteres metílicos, se llevó a cabo por CG con detector de ionización por llama (DILL). Resultados: los espectros UV, IR, RMN-¹H y RMN-13C mostraron que el ingrediente farmacéutico activo D00-3 está constituido por una mezcla de ácidos grasos libres saturados de elevado peso molecular, mientras las técnicas de CG-EM y CG-DILL permitieron asegurar la presencia de 13 ácidos grasos libres saturados de elevado peso molecular en proporciones definidas: C24:0 (0,2-0,6 por ciento), C25:0 (0,4-0,9 por ciento), C26:0 (2,0-3,1 por ciento), C27:0 (2,1-2,7 por ciento), C28:0 (30,0-37,5 por ciento), C29:0 (1,5-1,7 por ciento), C30:0 (17,0-18,6 por ciento), C31:0 (0,9-1,2 por ciento), C32:0 (6,9-8,9 por ciento), C33:0 (0,9-1,3 por ciento), C34:0 (7,2-11,1 por ciento), C35:0 (0,3-0,6 por ciento) y C36:0 (2,2-3,8 por ciento)(AU)

Introduction: D-003, an active pharmaceutical ingredient (API) purified from sugar cane (Saccharum officinarum L.) wax with cholesterol-lowering and antioxidant effects, is composed of a mixture of free saturated very long chain fatty acids (VLCFAs), each within specific relative concentration ranges as determined by the gas chromatography (GC). However, the spectroscopic characterization of D-003 had not been previously reported. Objective: to characterize the active pharmaceutical ingredient named D003 in accordance to its ultraviolet (UV), infrared (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR) and mass (MS) spectra. Methods: samples of six batches of D-003 (CNIC, Cuba) were evaluated by UV, FTIR, NMR-¹H, NMR-13C, and GC-MS techniques. For obtaining the mass spectra of D-003 acids, methyl (FAME) and trimethylsilyl ester derivatives were used. Quantification of free very long chain saturated fatty acids , analyzed as methyl ester derivatives, was made by GC with flame ionisation detector (FID). Results: UV, FTIR, and ¹H-NMR, 13C-NMR spectra showed that active pharmaceutical ingredient D-003 was composed of a mixture of free very long chain fatty acids, whereas the GC-MS and GC-FID techniques allowed ensuring the occurrence of 13 VLCFAs in set proportions: C24:0 (0.2-0.6 percent), C25:0 (0.4-0.9 percent), C26:0 (2.0-3.1 percent), C27:0 (2.1-2.7 percent), C28:0 (30.0-37.5 percent), C29:0 (1.5-1.7 percent), C30:0 (17.0-18.6 percent), C31:0 (0.9-1.2 percent), C32:0 (6.9-8.9 percent), C33:0 (0.9-1.3 percent), C34:0 (7.2-11.1 percent), C35:0 (0.3-0.6 percent) and C36:0 (2.2-3.8 percent). Conclusions: evidences from the UV, FTIR, NMR and GC-MS spectroscopic techniques prove that D-003 is composed of 13 saturated very long chain fatty acids, including octacosanoic acid as the most abundant one(AU)

Efecto in vitro del D-003 sobre la actividad enzimática de la 5-lipoxigenasa (5-LOX) / Effect in vitro of D-003 on 5-lipooxygenase (5-LOX) enzyme activity

Introducción: el D-003, mezcla de ácidos alifáticos primarios superiores purificada de la cera de la caña, inhibe la síntesis de colesterol. Trabajos recientes han demostrado que el D-003 resulta efectivo en modelos experimentales de osteoartritis y que inhibe la actividad de las enzimas COX1 y COX2, preferentemente la COX1, sin producir gastrotoxicidad. Ha sido referido que los inhibidores duales de las enzimas COX y 5-LOX presentan efectos antinflamatorios desprovistos de gastrotoxicidad o que incluso, pueden resultar gastroprotectores. De acuerdo con estos antecedentes, el D-003 podría ser un inhibidor dual de dichas enzimas. Objetivo: investigar el efecto in vitro del D-003 sobre la actividad enzimática de la 5-LOX, utilizando la fracción citosólica de leucocitos polimorfonucleares de ratas. Métodos: se utilizaron las condiciones de ensayo siguientes: fracción citosólica (50 µg de proteína) disuelta en solución reguladora borato 0,2 mol/L (pH 9) y ácido linoleico (7,8-250 mmol/L) como sustrato, ensayándose muestras paralelas incubadas con Tween-20/H2O (2 por ciento) (vehículo), D-003 (0,6-6 000 µg/mL) o extracto de Perna canaliculus (50 µg/mL) (sustancia de referencia). Se evaluó la actividad enzimática mediante el cambio de absorbancia a 234 nm producido por la formación de dienos conjugados y medido en espectrofotómetro UV-visible. Resultados: la adición de D-003 produjo una inhibición dosis dependiente de la actividad enzimática de la 5-LOX (r= 0,975; p< 0,05) (CI50= 23,06 µg/mL) in vitro. La magnitud de esta inhibición fue moderada, ya que la inhibición máxima, alcanzada a partir de 1 250 µg/mL, resultó de solo un 30 por ciento. Conclusiones: el estudio demuestra que el D-003 es capaz de inhibir la actividad enzimática de la 5-LOX in vitro, pero moderadamente(AU)

Introduction: D-003, a mix of higher primary aliphatic acids purified from sugarcane, inhibits cholesterol synthesis. Recent studies have demonstrated that D-003 is effective in experimental models of osteoarthritis and inhibits the enzymatic activities of COX1 and COX2, mainly that of COX1, without causing gastrotoxicity. It has been mentioned that the dual inhibitors of COX and 5-LOX enzymes present with anti-inflammatory effects and no gastrotoxicity or even they can have gastroprotective actions. According to this background, D-003 could be a dual inhibitor of COX and 5-LOX enzymes. Objective: to study the effects of D-003 on the enzymatic activity of 5-LOX in vitro, by using the cytosolic fraction of polymorphonuclear leukocytes of rats. Methods: the following testing conditions were used: cytosolic fraction (50 µg of protein) dissolved into 0,2 mol/L borate buffer solution (pH 9) and linoleic acid (7,8-250 mmol/L) as substrate. Parallel samples were incubated with Tween-20/H2O (2 percent) only (vehicle), D-003 (0,6-6 000 µg/mL) or green-lipped mussel (Perna canaliculus) extract (50 µg/mL) (reference substance). The enzymatic activity, evaluated by the conjugated diene formation, was assessed by the absorbance changes at 234 nm (5-LOX) measured in a UV-visible spectrophotometer. Results: by adding D-003, produced a dose dependent (r= 0,975; p< 0,05) (IC50= 23,06 µg/mL) in vitro inhibition of 5-LOX enzyme activity. The size of the inhibition was moderate, since the maximal inhibition, achieved from 1 250 µg/mL) on was only 30 percent. Conclusions: this study demonstrates that D-003 may inhibit in vitro the 5-LOX enzymatic activity, but in a moderate way(AU)

Efectos del D-003 sobre el perfil lipídico y la agregación plaquetaria en pacientes con diabetes tipo 2 / Effects of D-003 on lipid profile and platelet aggregation of type 2 diabetic patients

Los eventos coronarios constituyen la primera causa de muerte en sujetos con diabetes mellitus tipo 2. Un incremento en la agregación plaquetaria y altos niveles de colesterol asociado a la lipoproteína de baja densidad (C-LDL) contribuyen al riesgo coronario en diabéticos. El D-003, una mezcla de ácidos grasos obtenida de la caña de azúcar, ha mostrado reducir la agregación plaquetaria y los niveles séricos de C-LDL en sujetos normo e hipercolesterolémicos. Este estudio a doble ciego, controlado con placebo, investigó los efectos del D-003 sobre la agregación plaquetaria y el perfil lipídico en 50 diabéticos tipo 2, los que fueron aleatorizados para recibir después de un periodo inicial, D-003 (10 mg/día) o placebo por 10 semanas. Todos los sujetos completaron el estudio. El D-003 redujo significativamente la agregación plaquetaria inducida por ácido araquidónico (52,9%) y por colágeno (54,4%) y los niveles séricos de C-LDL (26,7%), colesterol total (CT) (19,6%) y triglicéridos (23,9%), mientras que incrementó el C-HDL (12,4%) en relación a los niveles básales y al grupo placebo. El D-003 fue seguro y bien tolerado. Se concluye que el D-003 redujo significativamente la agregación plaquetaria y los niveles séricos de C-LDL en pacientes con diabetes tipo 2, pero otros estudios deben confirmar estos resultados.

Coronan/ events are the leading cause of death in subjects with type 2 diabetes, and increased platelet aggregation and serum low-density lipoprotein-cholesterol (C-LDL) contribute to coronary risk in diabetes patients. D-003, a mixture of sugarcane wax acids, has shown to reduce platelet aggregation and serum C-LDL in normocholesterolemic and hypercholesterolemic subjects. This doubleblinded, placebo-controlled study investigated the effects of D-003 on platelet aggregation and lipid profile in 50 type 2 diabetes patients who were randomized, after a baseline phase, to D-003 (10 mg/d) or placebo for 10 weeks. Al I the subjects completed the study. D-003 significantly lowered arachidonic acid- (52.9%) and collagen-induced (54.4%) platelet aggregation, C-LDL (26-7%), total cholesterol (TC) (19.6%) and triglycerides (23.9%), while increased high-density lipoprotein-cholesterol (C-HDL) (12.4%) vs baseline and placebo. D-003 was safe and well tolerated. To conclude with, D-003 significantly reduced platelet aggregation and serum C-LDL in type 2 diabetes, but further studies should confirm these results.