ABSTRACT
La epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi es la transformación del tripomastigota sanguícola en epimastigota que ocurre en la porción anterior del tracto intestinal del insecto vector. Se ha reportado la activación de cisteín proteasas durante la epimastigogénesis in vitro en condiciones axénicas, sugiriendo la utilización de aminoácidos como fuente de carbono para la obtención de energía. El objetivo del presente trabajo fue estudiar a través de indicadores los cambios metabólicos producidos durante la diferenciación tripomastigota-epimastigota. Se partió de un 100% de tripomastigotas sobrenadantes de células Vero, incubados en medio LITB a 27ºC en condiciones de alta (epimastigogénesis horizontal) y baja (epimastigogénesis vertical) tensión de oxígeno. Se realizó contaje de parásitos (Cámara de Neubauer) y recuento diferencial (Giemsa) a diferentes tiempos de incubación (0, 1, 2, 4, 6, 8, 11 y 12 días). A cada tiempo se determinó en los sobrenadantes del medio de cultivo las concentraciones de glucosa y amoníaco, así como los valores de pH. Los resultados mostraron que: 1) Independientemente de la tensión de oxígeno se evidenció formas en diferenciación y amastigotas durante el proceso, siendo la aparición de epimastigotas más tardía en alta tensión de oxígeno; 2) El incremento poblacional fue significativamente mayor en condiciones de alta tensión de oxígeno, registrándose alta mortalidad de amastigotas durante los primeros días de incubación en la epimastigogénesis vertical; 3) El consumo de glucosa fue concomitante con la aparición de epimastigotas en ambas condiciones, siendo mayor en alta tensión de oxígeno; 4) No se registró liberación de amoníaco en ninguno de los casos estudiados; 5) Los valores de pH fueron similares hasta el sexto día en ambas condiciones, evidenciándose una acidificación gradual del medio de cultivo en alta tensión de oxígeno. Todo parece sugerir que durante la epimastigogénesis de T. cruzi, los parásitos involucrados en los procesos de diferenciación no muestran activación de las diferentes rutas metabólicas.
The epimastigogenesis of Trypanosoma cruzi is the transformation from bloodstream trypomastigote to epimastigote that occurs in the anterior portion of the intestinal tract of the insect vector. It has been reported cysteine proteases activation during axenic epimastigogenesis in vitro, suggesting the use of amino acids as a carbon source for the production of energy. The aim of this work was to study through indicators metabolic changes produced during the trypomastigote-epimastigote differentiation. We started with a 100% trypomastigotes derived from Vero cell supernatants, incubated in LITB medium at 27°C under high (horizontal epimastigogenesis) and low (vertical epimastigogenesis) oxygen tension. We estimated parasites number (Neubauer chamber) and differential morphology (Giemsa) at different incubation times (0, 1, 2, 4, 6, 8, 11 and 12 days). Each time was determined in the supernatants of the culture medium glucose and ammonia concentrations as well as the pH values. The results showed that: 1) Regardless of the oxygen tension it was evidenced differentiation forms and amastigote during the process, with the later occurrence of epimastigotes in high oxygen tension; 2) Population growth was significantly greater in high oxygen tension, registering high mortality of amastigotes during the firsts incubation days in the vertical epimastigogenesis; 3) Glucose consumption was concomitant with the appearance of epimastigotes in both conditions, being higher in high oxygen tension; 4) There was no ammonia release in any of the cases studied; 5) The pH values were similar to the sixth day in both conditions, showing gradual acidification of the culture medium at high oxygen tension. Everything seems to suggest that during the epimastigogenesis of T. cruzi parasites involved in differentiation processes show no activation of different metabolic pathways.
ABSTRACT
El medio ML15-HA permite simular in vitro los eventos morfogenéticos del ciclo vital de T. cruzi. Se ha evidenciado que los cambios morfológicos de la epimastigogénesis del clon Dm28c de T. cruzi en ML15-HA, ocurren más rápidamente que para otros aislados. Nuestro propósito fue investigar si los cambios macromoleculares ocurren concomitantemente con la rápida transformación morfológica. Tripomastigotas derivados de células infectadas se incubaron por diferentes tiempos en medio ML15-HA a 27ºC. Los cambios morfológicos se determinaron por microscopía de contraste de fases y coloración con Giemsa. Los perfiles peptídico y glicopeptídico se analizaron mediante SDS-PAGE y coloraciones específicas. Los cambios antigénicos se estudiaron mediante Western blot usando sueros anti-Tripomastigotas y anti-Epimastigotas. Los resultados muestran: (1) caída del porcentaje de tripomastigotas e incremento de amastigotas en las primeras 24 horas, con incremento gradual de epimastigotas a partir de 48 horas; (2) tres perfiles peptídicos y glicopeptídicos diferentes: tripomastigotas, epimastigotas a partir del día 4, y un perfil intermedio los días 2 y 3, demostrando la estrecha correlación entre los eventos morfológicos y los cambios proteicos y glicoproteicos; (3) los perfiles antigénicos revelaron estrecha relación entre los cambios morfológicos y la expresión de antígenos estadio-específicos. Los resultados obtenidos evidencian de manera concluyente que los cambios moleculares son más acelerados para el clon Dm28c en medio ML15-HA que en otros medios. Estos hallazgos abren la interrogante, sí la velocidad de la epimastigogénesis está determinada por la constitución genética del aislado o por la riqueza nutricional del medio de diferenciación.
The ML15-HA medium allows simulate in vitro morphogenetic events in the life cycle of T. cruzi. It has been demonstrated that the morphological changes of epimastigogenesis in ML15-HA of the T. cruzi clone Dm28c, occur faster than for other isolates. Our purpose was to investigate whether macromolecular changes occur concomitantly with rapid morphological transformation. Trypomastigotes derived from infected cells were incubated for different times in ML15-HA medium at 27°C. Morphological changes were determined by phase contrast microscopy and staining with Giemsa. Peptide and glycopeptide profiles were analyzed by SDS-PAGE and specific staining. Antigenic changes were studied by Western blot using serum anti-trypomastigotes and anti-epimastigotes. The results show: (1) decline in the percentage of trypomastigotes and amastigotes increased in the first 24 hours, epimastigotes gradually increases from 48 hours, (2) three peptide and glycopeptide profiles different: trypomastigotes, epimastigotes from the day 4 and an intermediate profile on days 2 and 3, showing the close correlation between morphological events and protein and glycoprotein changes, (3) antigenic profiles showed close relationship between the morphological changes and the expression of stage-specific antigens. The results show conclusively that the molecular changes are more rapid for clone Dm28c in ML15-HA medium than in other media. These findings open the question, if the epimastigogenesis speed is determined by the genetic constitution of isolated or nutritional wealth differentiation medium.
ABSTRACT
La transformación de tripomastigotas sanguíneos de Trypanosoma cruzi en epimastigotas, ocurre naturalmente en el intestino del insecto y se identifica como epimastigogénesis. Aquí reportamos que durante la epimastigogénesis in vitro, los tripomastigotas se transforman en formas redondeadas, biológica y antigénicamente equivalentes al estadio amastigota; con un tiempo de persistencia dependiente de la altura del medio de cultivo. Formas tripomastigotas procedentes de cultivo de tejidos infectados se incubaron en envases con diferentes alturas de medio LITB (3 y 83 mm), y se compararon las cinéticas de transformación hacia epimastigotas. Para la obtención de antígenos se colectaron masas de parásitos a diferentes tiempos de diferenciación. Los cambios morfológicos, incremento del inóculo y resistencia a complemento, se estudiaron por microscopía de contraste de fases y extendidos coloreados con Giemsa. Los cambios antigénicos se analizaron mediante Western Blot usando anticuerpo IgY anti-amastigotas. Los resultados mostraron que las formas redondeadas resisten la lisis por complemento, expresan antígenos amastigota-específicos y la velocidad de transformación hacia epimastigotas depende de la altura del medio sobrenadante en el cultivo. Las evidencias sugieren que además de caída de la temperatura, una baja tensión de oxígeno disuelto y una alta densidad de parásitos por área, aceleran el proceso de diferenciación.
Transformation of blood Trypanosoma cruzi tripomastigotes into epimastigotes occurs naturally at the insect gut and is identified as epimastigogenesis. Here we report that during in vitro epimastigogenesis, tripomastigotes transform into rounded forms, biologically and antigenically equivalent to the amastigote stadium, with a persistance time which depends on the height of the culture medium. Tripomastigote forms from cultures of infected tissues were incubated in flasks with different LITB medium heights (3 and 83 mm), and kinetics of transformation to epimastigotes were compared. Masses of parasites at different differentiation times were collected for antigen production. Morphological changes, inoculum increase and resistance to complement were studied by phase contrast microscopy and Giemsa stained smears. Antigenic changes were analyzed through Western Blot using an IgY anti-amastigote antibody. Results showed that rounded forms resist lysis by complement, express amastigote-specific antigens, and that the speed of transformation to epimastigotes depends on the height of the supernatant medium in the culture. Evidences suggest that apart from a temperature fall, a low dissolved oxygen tension and a high parasite per area density accelerate the differentiation process.
ABSTRACT
La epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi ocurre naturalmente en el intestino del hospedador invertebrado. Se desconoce si los cambios morfológicos que ocurren durante la transformación de los tripomastigotas sanguíneos en epimastigotas son idénticos para diferentes aislados de T. cruzi. Aquí mostramos un método útil para estudiar los eventos que ocurren durante la epimastigogénesis, comparando parásitos de diferentes procedencias epidemiológicas. Se alimentaron artificialmente ninfas de V estadio de Rhodnius prolixus con una solución ad hoc conteniendo tripomastigotas tipo-sanguíneo y siguiendo los cambios morfológicos por 8 días. Los contenidos del intestino anterior de las ninfas se obtuvieron decapitando y comprimiendo el abdomen lo que permitió obtener rápidamente casi 100% del inóculo con cargas entre 1,9 y 8,9 × 106 tripomastigotas/ninfa. El número de parásitos por ninfa y los cambios morfológicos se determinaron por Microscopia de Contraste de Fases y coloración con Giemsa. Las ninfas ingirieron 7,4 veces su peso de solución infectante, con volúmenes entre 101 y 357 µL (229 ± 66 mg), 50% de esa ingesta se eliminó como orina durante las primeras 24 h. Los tripomastigotas se transformaron en formas redondeadas antes de evolucionar a epimastigotas, siguiendo cinéticas diferentes según el aislado. Proponemos esta metodología para estudiar rápida y cuantitativamente los eventos tempranos de la epimastigogénesis de T. cruzi in vivo.
Trypanosoma cruzi epimastigogenesis naturally occurs in the intestine of the invertebrate host. It is not known whether the morphological changes that occur during transformation of bloodstream trypomastigotes to epimastigotes are identical for different T. cruzi isolates. This research shows a useful method for studying the events that occur during epimastigogenesis, comparing parasites from epidemiological sources. Rhodnius prolixus V stage nymphs were fed artificially with an ad hoc solution containing blood-like trypomastigotes and the morphological changes were examined during eight days. Anterior intestinal contents were removed by decapitation and squeezing the abdomen of the nymphs, which permitted obtaining quickly almost 100% of the inoculate with loads between 1.9 and 8.9 × 106 trypomastigotes/nymph. The number of parasites per nymph and morphological changes were determined using phase microscopy with Giemsa staining. The nymphs ingested 7.4 times their weight of the infecting solution with volumes between 101 e 357 µL (229 ± 66 mg); 50% of the ingest was eliminated as urine during the first 24 hours. The trypomastigotes transformed to rounded forms before evolving into epimastigotes following different kinetics according to the isolate. This method is proposed for rapid, quantitative study of the early events of epimastigogenesis for T. cruzi in vivo.