PRIMER REPORTE DE BEGOMOVIRUS INFECTANDO CULTIVOS DE AJÍ (Capsicum spp.) EN COLOMBIA / First report of begomoviruses infecting pepper (Capsicum spp.) crops in Colombia

RESUMEN Virus del género Begomovirus infectan cultivos de importancia económica en todo el mundo, incluyendo ají. A la fecha, en Colombia no hay reportes de la presencia de begomovirus infectando este cultivo, por lo que el objetivo de esta investigación fue identificar la presencia de virus de este género en ají empleando estrategias moleculares. Se colectaron 197 muestras de ají en diez municipios del Valle del Cauca. Se extrajo el DNA genómico total vegetal y mediante PCR se detectó la presencia de begomovirus. Para establecer la identidad molecular del virus se amplificaron fragmentos de 1,4 kb de muestras colectadas en Palmira y Vijes. Los fragmentos fueron clonados, secuenciados y analizados. Se encontró que el 85,7 % de las muestras de ají evaluadas fueron positivas para begomovirus. Los análisis de secuencia de los fragmentos virales de 1,4 kb arrojaron una identidad de 91,8 % entre ellos y los de secuencia de nucleótidos de los virus aislados en Vijes y Palmira mostró que éstos presentan los valores de identidad más altos (87,2 % y 86,6 %) con el virus de la distorsión de la hoja de maracuyá, un begomovirus aislado de maracuyá en Colombia. Estos análisis estarían indicando que este begomovirus aislado de ají podría ser una nueva especie. De acuerdo con la literatura, este es el primer reporte de un begomovirus infectando cultivos de ají en Colombia.

ABSTRACT Viruses of the genus Begomovirus infect crops of economic importance around the world, including pepper. To date, in Colombia there are no reports of the presence of begomoviruses infecting this crop; therefore, this research work aimed to identify the presence of viruses of this genus in pepper using molecular strategies. Around 197 pepper samples were collected in ten municipalities in Valle del Cauca. Total plant genomic DNA was extracted, and the presence of begomoviruses was detected by using PCR. In order to establish the molecular identity of the virus, fragments of 1.4 kb were amplified from samples collected in Palmira and Vijes municipalities. The fragments obtained were cloned, sequenced, and analyzed. The results show that about 85.7 % of the pepper samples evaluated were positive for begomoviruses. Sequence analysis of the viral fragments of 1.4 kb showed an identity of 91.8 % among them. The nucleotide sequence analysis of the begomoviruses isolated in Vijes and Palmira showed its highest identity values (87.2 % and 86.6 %) with the passion fruit leaf distortion virus, a begomovirus that is affecting passion fruit crops in Colombia. These sequences analyze would indicate that this begomovirus isolated from pepper could be a new species that has not been reported worldwide. To our knowledge, this is the first report of a begomovirus infecting pepper crops in Colombia.

Molecular characterization of a new Begomovirus isolated from five weeds species collected in tomato crops in Valle del Cauca / Caracterización molecular de un nuevo begomovirus aislado de cinco especies de arvenses colectadas en cultivos de tomate en valle del cauca

RESUMEN Las arvenses son hospederos alternos de begomovirus (Geminiviridae), los cuales facilitan su persistencia y propagación a cultivos de interés agronómico, como el tomate. El objetivo de esta investigación fue obtener el genoma completo de un begomovirus bipartita encontrado en Amaranthus dubius, Rivina humilis, Rhynchosia minima, Desmodium sp. y Caesalpinia sp., las cuales fueron colectadas en cultivos de tomate en Ginebra y Cerrito, Valle del Cauca. El genoma del begomovirus fue obtenido utilizando amplificación por círculo rodante y digestión con las enzimas EcoRI y EcoRV, las cuáles cortan el componente genómico A y B, respectivamente. Estos fragmentos fueron clonados, secuenciados y analizados. Finalmente, se verificó la presencia de este begomovirus en todas las arvenses mediante PCR específico. Se obtuvieron tres clonas EcoRI y cinco clonas EcoRV. Los fragmentos que portan los componentes A y B presentan un tamaño de 2 584 y 2 543 nt, respectivamente. El análisis de secuencia de nucleótidos del genoma begomoviral A con otros begomovirus previamente reportados, mostró la mayor identidad (90,9 %) con el virus del mosaico dorado de Rhynchosia de Yucatán. Tomando como base el criterio de demarcación actual para las especies de Begomovirus establecido por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus, el geminivirus aislado de las arvenses A. dubius, R. humilis, R. minima, Desmodium sp. y Caesalpinia sp., constituye una nueva especie begomoviral. Con base en la sintomatología observada en campo, se propone el nombre de Virus del mosaico dorado de Rhynchosia de Colombia para designar a esta nueva especie.

ABSTRACT The weeds are alternative hosts of begomoviruses (Geminiviridae), which facilitate their persistence and propagation to crops of agronomic interest, such as tomatoes. The objective of this investigation was to obtain the complete genome of a bipartite begomovirus found in Amaranthus dubius, Rivina humilis, Rhynchosia minima, Desmodium sp. and Caesalpinia sp., which were collected in tomato crops in Ginebra and Cerrito, Valle del Cauca. The genome of the begomovirus was obtained using rolling circle amplification and digestion with the enzymes EcoRI and EcoRV, which cut the genomic component A and B, respectively. These fragments were cloned, sequenced, and analyzed. Finally, the presence of this begomovirus in all weeds was verified by specific PCR. Three EcoRI clones and five EcoRV clones were obtained. The fragments carrying components A and B have a size of 2 584 and 2 543 nt, respectively. The analysis of the nucleotide sequence of the begomoviral A genome with other previously reported begomoviruses showed the highest identity (90.9 %) with the Rhynchosia golden mosaic virus Yucatán. Based on the current demarcation criterion for the Begomovirus species established by the International Committee on Taxonomy of Viruses, the geminivirus isolated from the weeds A. dubius, R. humilis, R. minima, Desmodium sp. and Caesalpinia sp., constitutes a new begomoviral species. Based on the symptoms observed in the field, the name of the Rhynchosia golden mosaic Colombia virus is proposed to designate this new species.

Primer reporte de un begomovirus presente en maracuyá amarillo [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degener)] en Valle del Cauca, Colombia / First report of a begomovirus presents in yellow passionfruit [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degene)] in Valle del Cauca, Colombia

El maracuyá amarillo es un cultivo de importancia económica para el Valle del Cauca, pero en los últimos años ha presentado una reducción de hasta un 80% en la producción debido a problemas virales. El objetivo del presente trabajo fue detectar y caracterizar parcialmente begomovirus que podrían estar afectando los cultivos de maracuyá amarillo localizados en dos zonas productoras del Valle del Cauca (La Unión y Palmira). Se colectaron hojas de maracuyá con síntomas típicos de enfermedad viral, se purificó su DNA genómico y se detectó la presencia de begomovirus bipartitas mediante PCR empleando cebadores específicos para el componente A y B, respectivamente. Cinco fragmentos de DNA correspondientes al genoma geminiviral A y B, fueron clonados, secuenciados y analizados con herramientas bioinformáticas. Los resultados evidencian por primera vez en Colombia de la presencia de un begomovirus en maracuyá amarillo. El análisis de la secuencias de nucleótidos indica que este begomovirus está más relacionado con el virus del mosaico enano del frijol, un geminivirus que afecta frijol en Colombia, y no con el virus de la distorsión severa de la hoja de maracuyá, el cual se reportó afectando maracuyá amarillo en Brasil. A la fecha, este resultado constituiría el primer reporte de un begomovirus (perteneciente a la familia Geminiviridae) que afecta maracuyá amarillo en Colombia y que podría ser diferente de otros begomovirus previamente reportados a nivel mundial afectando este cultivo.

The yellow passion fruit is a crop of economic importance to the Valle del Cauca, but in recent years has been a reduction of up to 80% in production due to viral problems. The aim of this study was to detect and characterize partially begomovirus that could be affecting crops of yellow passionfruit located in two growing areas of the Valle del Cauca (La Union and Palmira). Passionfruit leaves with typical symptoms of viral disease were collected, purified genomic DNA and its bipartite begomovirus were detected by PCR using primers specific for component A and B, respectively. Five DNA fragments corresponding to geminiviral A and B genome were cloned, sequenced and analyzed with bioinformatics tools. The results show for the first time in Colombia the presence of a begomovirus in yellow passionfruit. The analysis of the nucleotide sequences indicates that this begomovirus is more related to bean BDMV, a geminivirus affecting beans in Colombia, not PSLDV, which was reported affecting yellow passionfruit in Brazil. To date, this result would be the first report of a begomovirus (belonging to the family Geminiviridae) affecting yellow passion fruit in Colombia, and that might be different from other begomovirus previously reported worldwide affecting this crop.

Identification and validation of a virus-inducible ta-siRNA-generating TAS4 locus in tomato.

Trans-acting small interfering RNAs (ta-siRNAs) are a class of endogenous small RNA, associated with posttranscriptional gene silencing. Their biogenesis requires an initial microRNA (miRNA)-mediated cleavage of precursor RNA. Around 20 different ta-siRNA-producing loci (TASs), whose sequences are conserved, are reported in plants. In tomato, two TAS gene families have been identified, which are found to target auxin response factor gene and bacterial spot disease resistance protein Bs4 gene. Using high-throughput computational and experimental approach, we identified a new locus-producing ta-siRNA in tomato. We have also identified the putative miRNA regulating the production of ta-siRNA from this locus. The ta-siRNAs generated from TAS4 were up-regulated upon infection with a DNA virus. The potential targets of ta-siRNAs were predicted to be variety of proteins including MYB transcription factors and cell cycle regulators for some of the ta-siRNAs produced.

Optimización de las condiciones de inoculación por biobalística de un Begomovirus en tomate y tabaco / Optimizing conditions for biolistic inoculation of Begomovirus in tomato and tobacco

La transmisión experimental de Begomovirus es problemática. La mayoría de estos virus se pueden transmitir de planta a planta por su vector biológico, Bemisia tabaci. Las inoculaciones experimentales con mosca blanca son problemáticas debido a sus hábitos de alimentación, requerimiento de una planta viva infectada e instalaciones de contención para el vector. Por su parte la inoculación mecánica de Begomovirus es posible, pero generalmente a tasas bajas y no en todos los casos. Por esta razón el bombardeo de partículas (biobalística) de DNA viral como una estrategia de inoculación fue desarrollada. La posibilidad de utilizar el dispositivo de mano Helios Gen Gun System (Biorad®), un equipo de biobalística, para la transmisión de un Begomovirus bipartita a plantas de tomate y tabaco fue ensayado y optimizado. Los parámetros evaluados fueron: número de disparos (1-2), presión de helio (220 y 320 psi) y diámetro de las partículas de oro (0.6 y 1.6µm). Los síntomas característicos de la enfermedad viral (clorosis, mosaico y deformación de la hoja) aparecieron 3 semanas después del bombardeo en las hojas jóvenes no inoculadas. La replicación del DNA viral en las plantas se confirmó por Reacción en cadena de la polimerasa. Plantas infectadas en un 100 se obtuvieron cuando en el bombardeo se emplearon partículas de oro de 1.6 µm recubiertas con DNA viral a una presión de 320psi. A nuestro entender este es el primer reporte en Colombia de la inoculación directa de plantas de tomate y tabaco con un Begomovirus bipartita usando un dispositivo portátil de biobalística.

Experimental transmission of Begomovirus is problematic. Most Begomoviruses can be transmitted readily from plant to plant by the whitefly vector, but this also requires a live infected plant and extensive facilities to maintain the insect. Whitefly inoculations can also be problematic because of their preferential feeding habits on certain plants. Mechanical inoculation of Begomovirus is possible but generally at low rates and for others not at all. For this reason particle bombardment (biolistic) of DNA viral as an inoculum was developed. The possibility of using the Helios Gen Gun System (Biorad®), a biolistic hand-held device, for transmitting Begomovirus bipartite to tomato and tobacco plants was assayed and optimized. Biolistic inoculation was carried out with the hand held device at 220 or 320 psi, applying 1 or 2 shots /plant and using gold particles of 0.6 or 1.6µm in size. Characteristic symptoms of viral disease (chlorosis, mosaic and leaf deformation) appeared 3 weeks post-inoculation in the newly developing leaves. Replication of the viral DNA in plants was confirmed by Polymerase Chain Reaction. All bombarded plants became infected when biolistic inoculation was carried out with the hand held device at 320psi and using 1.6 µm gold particles in size. To our knowledge this is the first report in Colombia of successful direct inoculation of tomato and tobacco plants with Begomovirus bipartite geminivirus using a biolistic hand-held device.

Benzothiadiazole (BTH) induces resistance to Pepper golden mosaic virus (PepGMV) in pepper (Capsicum annuum L.)

Pepper is an economically important crop in many countries around the world but it is susceptible to many diseases. In Mexico, diseases caused by bipartite begomoviruses have emerged as important problems in pepper. Several control strategies have been explored wiht little success; most of them are based on the avoidance of virus transmission and the breeding for resistance. Abiotic inducers can act at various points in the signaling pathways involved in disease resistance, providing long-lasting, wide-spectrum resistance. Benzothiadiazole (BTH) shares the property of activating the systemic acquired resistance pathway downstream from the SA signaling. In this work, resistance to PepGMV infection was induced in pepper plants by activating the SA pathway using BTH treatment. The resistance was characterized by evaluating symptom appearance, virus accumulation and viral movement. Our results showed that BTH could be an attractive alternative to induce geminivirus resistance in pepper plants without a significant damage of the fruit quality and productivity.

Distribución y diversidad genética de Begomovirus que infectan tomate (Solanum lycopersicum L) en Colombia / Distribution and genetic diversity of tomato –infecting Begomovirus in Colombia

Las enfermedades causadas por los begomovirus, (Familia Geminiviridae) constituyen una serie limitante para la producción del tomate en Colombia. Sin embargo, la caracterización de estos virus no ha sido realizada al momento. Aquí­ presentamos los resultados de un muestreo a nivel nacional que buscaba conocer la distribución y diversidad genética de los geminivirus que están afectando el cultivo de tomate en Colombia. Los virus fueron detectados mediante PCR, empleando primer universales específicos para el género Begomovirus. Los fragmentos amplificados por PCR fueron sometidos a un análisis tipo RFLP cuyos resultados evidenciaron presencia de infecciones mixtas e individuales de geminivirus en la mayoría de las muestras recolectadas en campo. Los fragmentos amplificados por PCR fueron clonados y secuenciados. El analísis de secuencia y filogenético mostró que los aislados begomovirales colombianos eran gemininivirus bipartitas típicos del Hemisferio Occidental y que algunos eran variantes de PYMV y otros de ToTEV. Mediante el análisis de los elementos cis-regulatorios (iterones) presentes en el promotor del gen de la proteína asociada a replicación (Rep) de los begomovirus aislados es posible postular eventos de pseudorecombinacién que podrían suceder entre ellos durante la ocurrencia de infecciones mixtas en tomate.

Diseased caused by begomoviruses (Family Geminiviridae) constitute a serious constraint to tomato production in Colombia. However characterization of these new viruses had not been carried out so far. Here we report a large scale survey on the distribution and genetic diversity of tomato infecting geminiviruses which are affecting mayor growing area of this crop in the country. Viruses were detected by PCR using universal primers for members of genus Begomovirus. The RFLP analysis of PCR-amplified fragments showed individual and mixed infections of several geminiviruses in many of the samples. PCR-amplified fragments were cloned and sequenced. Based on sequence comparations and phylogenetic analysis, the Colombian geminivirus isolates were new world bipartite geminiviruses showing close relationship with PYMV and ToVEV. By means of bioinformatic analysis of cis-acting elements (iterons) involved in DNA replication of rep gene of Colombian geminivirus isolates was possible to postulate possible pseudorecombinación events that could occur between them but also confirm the occurrence of mixed infections.

Detección de geminivirus asociados a la alstroemeria (alstroemeria l.) En villa guerrero, estado de México / Detection of geminivirus associated to alstroemeria (alstroemeria l.) In villa guerrero, state of Mexico / Detecção de geminivírus associados a alstroemeria (alstroemeria l.) Em villa guerrero, estado do México

En plantaciones de alstroemeria (Alstroemeria L.) de Villa Guerrero, Estado de México, se han detectado plantas con síntomas similares a los inducidos por geminivirus en otros cultivos hortícolas. En dichas plantaciones también se ha observado la presencia de la mosquita blanca, considerada como el vector más eficiente de estos virus. El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de geminivirus en plantas de alstroemeria. Mediante PCR, usando los iniciadores MotCP2118/MotCP2123, se obtuvo un segmento de ~600pb, similar al del control positivo correspondiente a chile infectado con el begomovirus pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV, antes pepper huasteco virus) en plantas sintomáticas, mientras que en las asintomáticas la detección fue negativa. Plantas de Nicotiana glutinosa, N. benthamiana, N. rustica, N. tabacum var. xanthi y Datura stramonium inoculadas por biobalística con ADN total obtenido de alstroemerias con síntomas y positivas a PHYVV mediante PCR, mostraron mosaicos leves y deformación de hojas, mientras que en plantas de Capsicum annuum se observaron mosaicos, necrosis en nervaduras y abultamientos en hojas. Con el ADN de estas plantas también se obtuvieron bandas correspondientes al PHYVV, pero en las monocotiledóneas bombardeadas, incluyendo alstroemeria, no fue detectado el fragmento. La secuencia de oligonucleótidos de los productos de PCR mostró 98% de homología con el begomovirus PHYVV. Aunque no fue posible reproducir en alstroemeria los síntomas observados en campo, sí se evidenció mediante PCR la presencia de un geminivirus similar al PHYVV en tejido de plantas sintomáticas.

In alstroemeria (Alstroemeria L.) plantations located in Villa Guerrero, Mexico State, plants with symptoms similar to those induced by geminivirus in other horticultural crops have been detected. In addition, the presence of whiteflies, which are considered the most efficient vectors of these viruses, has been observed in these plantations. The goal of this work was to detect the presence of this geminivirus species in alstroemeria plants. By means of PCR analysis using primers MotCP2118/MotCP2123, a fragment of ~600pb similar to the amplicon obtained from PHYVV-infected positive control was amplified only from symptomatic plants. Nicotiana glutinosa, N. benthamiana, N. rustica, N. tabacum var. xanthi and Datura stramonium plants were inoculated by bombardment with total DNA obtained from symptomatic alstroemerias and positive to PHYVV by means of PCR. Inoculated plants showed mild mosaics and deformation of leaves, whereas in the leaves of Capsicum annum plants, mosaics, vein necrosis and blisters were observed. Using DNA from these plants as template in PCR, amplicons corresponded to PHYVV were also obtained; however, in bombarded monocotyledons, including alstroemeria, this fragment was not detected. The sequence of oligonucleotides from the PCR products showed 98% homology to PHYVV geminivirus. Even though symptoms presented by alstroemeria plants in the field were not reproduced, the presence of a geminivirus similar to PHYVV in tissue of symptomatic plants was evidenced through PCR.

Em plantações de alstroemeria (Alstroemeria L.) de Villa Guerrero, Estado do México, se tem detectado plantas com sintomas similares aos induzidos por geminivírus em outros cultivos hortícolas. Em ditas plantações também tem sido observada a presença da mosquinha branca, considerada como o vetor mais eficiente destes vírus. O objetivo do presente trabalho foi detectar a presença de geminivírus em plantas de alstroemeria. Mediante PCR, usando os iniciadores MotCP2118/MotCP2123, obteve-se um segmento de ~600pb, similar ao do controle positivo correspondente a chile infectado com o begomovírus pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV, antes pepper huasteco virus) em plantas sintomáticas, enquanto que nas assintomáticas a detecção foi negativa. Plantas de Nicotiana glutinosa, N. benthamiana, N. rustica, N. tabacum var. xanthi e Datura stramonium inoculadas por biobalística com DNA total obtido de alstroemerias com sintomas e positivas a PHYVV mediante PCR, mostraram mosaicos leves e deformação de folhas, enquanto que em plantas de Capsicum annuum se observaram mosaicos, necrose em nervaduras e protuberâncias em folhas. Com o DNA destas plantas também se obtiveram bandas correspondentes ao PHYVV, mas nas monocotiledóneas bombardeadas, incluindo alstroemeria, não foi detectado o fragmento. A sequência de oligonucleotídeos dos produtos de PCR mostrou 98% de homologia com o begomovírus PHYVV. Embora não foi possível reproduzir em alstroemeria os sintomas observados em campo, sím foi evidenciada, mediante PCR, a presença de um geminivírus similar ao PHYVV em tecido de plantas sintomáticas.