Modification and Expression of Beta-1,4-Endoglucanase encoding sequences of fungal origin in Escherichia coli BL21 / Modificación y expresión de secuencias codificantes de Beta-1,4-Endoglucanasa de origen fúngico en Escherichia coli BL21

ABSTRACT Lignocellulose is the main and most abundant component of biomass. Annually, 200 million tons are generated in the world. Colombia has a high production of lignocellulosic residues that can be used in many industrial processes such as bioethanol produc-tion, promoting the bioeconomy. The objective of the present work was to express lignocellulolytic enzymes of eukaryotic origin in Escherichia coli BL21 (DE3). Initially, endoglucanase eukaryotic genes were selected and modified using bioinformatics methods for their production in E. coli BL21 (DE3) and saccharification of pure cellulose substrates. The gene selected for its modification and expression was egl B from the fungus Aspergillus nidulans. Subsequently the enzyme integrity was tested by 3D modeling and molecular docking, as well as the conformation of its active site and its affinity for substrates of interest. Finally, cloning of the modified gene in plasmid pET151 TOPO was made and transformed in the strain E. coli BL21 (DE3) where several lignocellulose degradation tests were carried out using semiquantitative methods for the enzyme activity in carboxymethylcellulose. The presence of the three genes of interest within the plasmid pET151 TOPO and within the transformed cells of E. coli TOP10 and E. coli BL21 (DE3) was verified by colony PCRs performed. The presence of this gen was corroborated by sequencing. Expression of the modified endoglucanase enzyme was achieved in E. coli BL21 (DE3) expression cells, in soluble and functional form, demonstrated by the hydrolysis of the CMC substrate.

RESUMEN La lignocelulosa es el componente principal y más abundante de la biomasa. Anualmente se generan 200 millones de toneladas en el mundo. Colombia tiene una alta producción de residuos lignocelulósicos que pueden ser utilizados en muchos procesos industriales como la producción de bioetanol, promoviendo la bioeconomía. El objetivo del presente trabajo fue expresar enzimas lignocelulolíticas de origen eucariota en Escherichia coli BL21 (DE3). Inicialmente, los genes eucariotas de endoglucanasa se seleccionaron y modificaron mediante métodos bioinformáticos para su producción en E. coli BL21 (DE3) y la sacarificación de sustratos de celulosa. El gen seleccionado para su modificación y expresión fue eglB del hongo Aspergillus nidulans. Posteriormente se evaluó la integridad de la enzima mediante modelado 3D y acoplamiento molecular, así como la conformación de su sitio activo y su afinidad por sustratos de interés. Finalmente, se realizó la clonación del gen modificado en el plásmido pET151 TOPO y se transformó en la cepa E. coli BL21 (DE3) donde se realizaron varios ensayos de degradación de lignocelulosa utilizando métodos semicuantita-tivos para la actividad enzimática en carboximetilcelulosa. La presencia del gen de interés dentro del plásmido pET151 TOPO y dentro de las células transformadas de E. coli TOP10 y E. coli BL21 (DE3) se verificó mediante PCR de colonia. La presencia de este gene se corroboró por secuenciación eglB. La expresión de la enzima endoglucanasa modificada se logró en células de E. coli BL21 (DE3), en forma soluble y funcional, demostrada por la hidrólisis del sustrato de CMC.

Biologia molecular de leveduras e sua aplicação biotecnológica para estudo de mecanismos celulares do câncer e seu tratamento / Molecular biology of yeast and its biotechnological application to study the cellular mechanisms of cancer and its treatment

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o eucarioto mais bem caracterizado quanto às vias metabólicas, celulares e funções de genes. Calcula-se que dos 6.000 genes codificadores de proteínas, pelo menos 3.000 tenham homologia com genes humanos. Além disso, mesmo quando não há homologia direta, os mecanismos moleculares são conservados e em ensaios de complementação de função é possível caracterizar funções análogas em humanos. Leveduras apresentam além de mecanismos conservados, diversas semelhanças metabólicas com células tumorais; talvez a mais marcante delas seja a repressão catabólica por glicose. Esse fenômeno causa uma superativação da via glicolítica e inibição da cadeia respiratória, o que lembra muito o efeito Warburg apresentado pelas células tumorais. Esse comportamento metabólico tem relação estreita com a homeostase redox celular. Estes fatores mostram o quanto à caracterização dessas células fúngicas pode ser aplicada ao entendimento e tratamento do câncer. Mesmo assim, 20 anos após o término do sequenciamento do genoma de S. cerevisiae, mais de 1.000 genes continuam anotados como não caracterizados. Além disso, as leveduras têm papel fundamental na produção biotecnológica de insumos farmacêuticos. Nesse texto sistematizado relato as contribuições dos meus estudos, juntamente com os resultados do meu grupo de pesquisa, usando a biologia molecular das leveduras, para responder questões aplicadas à compreensão de funções celulares (com destaque à resposta antioxidante), mecanismos moleculares de resposta aos antitumorais e produção de biofármacos. Além de modelo celular, as leveduras representam excelentes plataformas para expressão heteróloga de proteínas de interesse Biotecnológico-Farmacêutico

The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most well characterized eukaryote for metabolic, cellular and gene functions. It is estimated that of the 6,000 protein-encoding genes, at least 3,000 have homology to human genes. Moreover, even when there is no direct homology, the molecular mechanisms are conserved and through function complementation assays it is possible to characterize analogous functions in humans. Yeasts present, in addition to conserved mechanisms, diverse metabolic similarities with tumor cells; perhaps the most remarkable of them is the catabolic repression by glucose. This phenomenon causes an over activation of the glycolytic pathway and inhibition of the respiratory chain, which strongly resembles the Warburg effect presented by tumor cells. This metabolic behavior is closely related to cellular redox homeostasis. These factors show how much the characterization of these fungal cells can be applied to the understanding and treatment of cancer. Even so, 20 years after the end of the sequencing of the S. cerevisiae genome, more than 1,000 genes remain annotated as uncharacterized. In addition, yeasts play a key role in the biotechnological production of pharmaceutical inputs. In this systematized text I show the contributions of my studies, together with the results of my research group, using molecular biology of yeast to answer questions applied to understanding cellular functions (with emphasis on the antioxidant response), molecular response mechanisms to antitumor drugs and biopharmaceutical production. In addition to cellular model, yeasts represent excellent platforms for the heterologous expression of proteins of Biotechnological-Pharmaceutical interes

O casal homossexual e a inseminação artificial heteróloga / The homosexual couple and the artificial heterologous insemination

Objetivos: Avaliar o perfil epidemiológico de pacientes submetidas à inseminação artificial heteróloga (IAH), estabelecer a taxa de gravidez e de gestação múltipla e reconhecer a prevalência dos casais homossexuais como elemento de indicação. Metodologia: Estudo descritivo, retrospectivo e quantitativo feito de janeiro de 2009 a outubro de 2014, na Clínica Fértile – Reprodução Humana, que avaliou os procedimentos de IAH. Resultados: Foram analisadas 67 pacientes submetidas a 156 ciclos de tratamento, média de 2,3 procedimentos por paciente. A faixa etária mais prevalente situou‐se entre 18 e 35 anos (55,2%). A principal indicação foi o fator masculino (70,1%). O padrão espermático mais prevalente foi entre 1 e 5 milhões de espermatozoides/mL (53,9%). A taxa de gravidez por ciclo foi de 17,3%. Foram obtidas 7 gestações múltiplas (4,48%). Das 67 pacientes, 9 procuraram a IAH por serem casais homossexuais (13,5%). Conclusão:O perfil epidemiológico foi idade entre 18 e 35 anos, indicação principal o fator masculino e padrão espermático entre 1 e 5 milhões. A taxa de gravidez por ciclo foi de 17,3% com uma taxa de gestações múltiplas de 4,48%. A prevalência de casais homossexuais durante o estudo foi de 13,5%.

Aims: To evaluate the epidemiological profile of patients undergoing heterologous artificial insemination (HAI), establish the rate of pregnancy and multiple pregnancy and recognize the prevalence of homosexual couples as an indication element for the procedure. Methods: A descriptive, retrospective and quantitative study conducted from January 2009 to October 2014, in the Fertile Clinic ‐ Human Reproduction assessing the HAI procedures. Results: We analyzed 67 patients who underwent 156 cycles of treatment with an average of 2.3 procedures per patient. The most prevalent age group was among 18 and 35 representing 55.2%. The main indication for the procedure was the male factor (70.1%). In most prevalent standard sperm concentration was between 1 and 5 million sperm/ml (53.9%) The cycle for pregnancy rate was 17.3%. Seven obtained multiple pregnancies (4.48%) and 5 of these were twins (3.2%) and 2 triplets (1.28%). Of the 67 patients, nine sought to HAI for being homosexual couples representing a rate of 13.5% of patients. Conclusion: The epidemiological profile was represented as follows: age among 18 and 35, the main indication was the male factor and the spermatic standard donated semen was between 1 and 5 million. The cycle for pregnancy rate was 17.3% with a rate of multiple pregnancies of 4.48%, 3.2% were twins and 1.28% triplets. The prevalence of homosexual couples during the study was 13.5%.

Tasa de embarazo de inseminación intrauterina heteróloga usando cánulas de transferencias de embriones

Objetivos: Conocer la tasa de embarazo de inseminación intrauterina (IIU) heteróloga, usando las cánulas de transferencia de embriones (TE). Diseño: Estudio retrospectivo. Institución: Centro de Fertilidad Procrear, Lima, Perú. Participantes: Parejas en tratamiento de infertilidad. Intervenciones: Se estudió todos los casos de procedimientos de IIU heteróloga en los que se usó semen de donante del banco de esperma, entre 2007 y septiembre de 2010. Todas fueron realizadas por el mismo ginecólogo y el mismo biólogo. Las IIU se realizaron utilizando cánulas de TE Frydman-Soft con guía, previa medición ecográfica del cérvix. Se analizó la tasa de embarazo por ciclo y por paciente, así como los factores asociados al embarazo. Para el análisis estadístico se usó Epi Info 3.5.1. Principales medidas de resultados: Tasa de embarazos. Resultados: Se realizó 30 procedimientos de IIU heteróloga, en 26 pacientes, con edad promedio 32,6 ± 5,5 años (rango 20 a 41 años), siendo el 40% mayor de 35 años. La tasa de embarazo fue 40% por ciclo y 46% por paciente. La mayoría (87%) tuvo solo un intento. La edad menor de 35 años y la respuesta folicular de 2 a 4 folículos mayores de 17 mm se asociaron a mejores resultados; mientras que tener una trompa obstruida, grosor endometrial ≤ 6 mm o inseminación después del día 15 del ciclo se asociaron a resultados negativos. Conclusiones: La IIU heteróloga con cánulas de transferencia de embriones ofrece excelentes resultados en tasa de gestación; además, sirve de entrenamiento para médicos que todavía no realizan procedimientos de alta complejidad.

Objectives: To determine the heterologous intrauterine insemination (H-IUI), rate of pregnancy by using embryo transfer cannula. Design: Retrospective study. Setting: Procrear Fertility Center, Lima, Peru. Participants: Couples in infertility treatment. Interventions: All H-IUI procedures using sperm bank donor semen from 2007 through September 2010 were studied, all performed by the same gynecologist and the same biologist. IUI was performed using Frydman-Soft embryo transfer cannula with guide following cervix measurement by ultrasound. Rate of pregnancy per cycle and per patient was analyzed as well as factors associated with pregnancy. Epi Info 3.5.1 was used for statistical analysis. Main outcome measures: Pregnancy rate. Results: Thirty H-IUI proceedings were performed in 26 patients with average age 32.6 ± 5.5 years (range: 20-41 years), 40% over 35 years. Pregnancy rate was 40% per cycle and 46% per patient. Most (87%) had only one attempt. Age less than 35 years and 2 to 4 follicles more than 17 mm were related to best results. Having an obstructed tube, endometrial thickness ≤ 6 mm, or insemination after cycle day 15 were associated to negative results. Conclusions: Heterologous IUI with Frydman-Soft embryo transfer cannula provided excellent results in conception and served for training physicians who still do not perform high-complexity procedures.

Inseminação artificial heteróloga: implicações bioéticas e jurídicas / Heterologous artificial insemination: bioethical and legal implications

Objetivo: Enfocar as implicações bioéticas e jurídicas sobre a inseminação artificial heteróloga, em especial, no que concerne ao conflito entre o direito à identidade genética daquele que foi concebido e o direito à privacidade do doador de material genético. Material e Métodos: Trata-se de uma pesquisa de natureza bibliográfica consubstanciada na literatura pertinente ao tema investigado. Resultados: A incidência de problemas de fertilidade é comum na população. Tais dificuldades geram sofrimento àqueles que desejam ser pais, mas não podem conceber filhos pelo método natural. A inseminação artificial heteróloga constitui um tipo de reprodução assistida, em crescente uso, a qual traz repercussões bioéticas e jurídicas. A partir do levantamento bibliográfico, verificou-se que, diante dos desafios éticos e morais oportunizados pela técnica de reprodução assistida heteróloga, o direito brasileiro encontra-se superado, pois não consta do ordenamento jurídico átrio, uma lei específica para regulamentar a situação dos envolvidos no processo: pais sociais, genitores e a pessoa nascida, com base no princípio da dignidade da pessoa humana. Conclusão: O estudo evidencia que juridicamente, a paternidade constrói-se e firma-se na afetividade e não na hereditariedade genética, assim, a pessoa nascida nesse processo fica ausente da possibilidade de conhecer suas origens.

Objective: To focus on the bioethical and legal implications of heterologous artificial insemination, especially regarding to conflicts between the right to the genetic identity of that who was conceived and the right to privacy of the donor of genetic material. Material and Methods: This is a research of bibliographic nature consubstantiated in the literature concerning the investigated theme. Results: The incidence of fertility problems is common in the population. These difficulties cause suffering to those who wish to be parents, but cannot conceive children by the natural method. Heterologous artificial insemination constitutes a type of assisted reproduction in increased use, which brings bioethical and legal impacts. From the bibliographic survey, it was found that given the ethical and moral challenges offered by the technique of heterologous assisted reproduction, Brazilian law is overcome, because it is not in the law court a specific law to regulate the situation of those involved in the process: social parents, parents and the born person, based on the principle of human dignity. Conclusion: The study shows that, legally, fatherhood is constructed and stands in affection and not in genetic inheritance. This way, a person that was born in this process is missing the opportunity to know their origins.

Avaliação do potencial protetor da vacina gênica pvaxapa- dmt-me no modelo experimental de tuberculose / Protective potential evaluation of genetic vaccines pvaxapa- dmt-me in the experimental model of tuberculosis

A tuberculose (TB) é responsável por dois milhões de mortes a cada ano, apesar daampla utilização da vacina BCG (Bacilo Calmette-Guérin). Embora essa vacina nãoproteja contra a TB pulmonar no adulto, protege contra as formas graves da TB nainfância. Para muitos autores, a imunização heteróloga (prime-boost) talvezseja uma das estratégias mais importantes e realistas para o controle da TB,principalmente nos países endêmicos. Muitos estudos têm demonstrado que aimunização com BCG seguido de reforço com vacina gênica (genes de M.tuberculosis) induz melhor proteção contra TB do que somente a vacina BCG. Alémdisso, a estratégia prime-boost utilizando microesferas biodegradáveis pareceser uma imunização promissora para estimular a resposta imune de longa duração.A glicoproteína APA foi identificada como importante antígeno imunodominante,induzindo níveis significativos de proteção contra M. tuberculosis. Assim, esteestudo teve como objetivo avaliar a eficácia protetora da imunização heteróloga emmodelo experimental de TB. Para isso, camundongos BALB/c foram imunizados porvia subcutânea com BCG seguido de um reforço por via intramuscular com aformulação vacinal contendo apa e DMT co-encapsuladosem microesferas (BCG/APA). Essa estratégia prime-boost foi eficiente na indução daresposta imune protetora à infecção por M. tuberculosis, caracterizada pela reduçãosignificativa do número de bacilos no pulmão destes animais na fase mais tardia dainfecção (70 dias após desafio). Além de ser significativamente mais imunogênciaque a vacina BCG, permitiu uma melhor preservação do parênquima pulmonar, comredução do número e tamanho dos granulomas, limitando a extensão da injúriatecidual induzida pela infecção e restringindo a inflamação no tecido alveolar. Apotencialização do efeito protetor da vacina BCG induzida pelo reforço com a vacinapVAXapa+DMT-Me sugere que a estratégia utilizada pode ser importante para aprevenção da TB...

Tuberculosis (TB) is responsible for two millions of deaths each year despite thewidespread use of BCG vaccine (Bacillus Calmette-Guérin). Although this vaccinedoes not protect against adult pulmonary TB, it is protective against severe forms ofchildhood TB. For many authors, heterologous prime-boost regimen is perhaps themost realistic strategy for future TB control, especially in endemic countries. Manystudies have demonstrated that BCG-prime DNA-(M. tuberculosis genes)-boosterinduce greater protection against TB than BCG alone. APA glycoprotein has beenidentified as major immunodominant antigen and induces significant levels ofprotection against M. tuberculosis. Moreover, prime-boost strategy by usingbiodegradable microspheres seems to be a promising immunization to stimulate longlasting immune response. Thus, this study had as aim to investigate the immuneprotection against M. tuberculosis challenge in mice based on BCG priming and DNAvaccine boosting. For that, BALB/c mice were inoculated subcutaneously with aheterologous BCG priming-DNA boosting immunization using pVAXapa and TDM coencapsulatedin microspheres (BCG/APA), intramuscularly. This prime-boost strategywas effective in inducing protective immune response against M. tuberculosisinfection, characterized by significant lower numbers of bacilli in the lungs of theseanimals, in the late phase of infection (70 days after infection). In addition to beingsignificantly more immunogenic than BCG, it allowed better preservation of the lungparenchyma and reduction in the number and size of granulomas, limiting the extentof lung injury induced by infection and inflammation in the alveolar tissue. Theimprovement of the protective effect of BCG vaccine mediated by pVAXapa boostersuggests that our strategy can be important in the treatment for prevention of TB...

Gravidez de substituição / Surrogate pregnancy

A tecnologia e a ciência médica aplicada tem criado as condições para tornar possível que casais inférteis, antes condenados a não ter filhos pelos meios biológicos usuais, hoje alcancem este objetivo. Os formidáveis progressos científicos com a reprodução medicamente assistida, num primeiro momento, permitiram superar a infertilidade causada por ovulação insuficiente ou um número pequeno de espermatozóides com a fertilização in vitro. Num segundo momento, depois de gerado o embrião, implanta-lo no útero materno e, finalmente, conseguir a sua implantação em outro útero que não o da dona do embrião gerado em laboratório. Neste estágio - a gravidez de substituição - tem gerado inúmeros questionamentos de ordem ética e religiosa e jurídica. Se de um lado a lei já tem uma visão relativamente pacificada - dentro da ótica da estrutura familiar vigente - e os fóruns éticos já tenham definido deontologicamente os passos deste processo, o campo religioso continua postando-se de maneira contrária e com uma abertura muito estreita para discussões sobre o tema. No maior país católico do mundo, no entanto, muitos casais - mesmo sabendo estar contrariando normas explicitadas por documentos eclesiásticos - têm buscado, cada vez mais, este recurso que a ciência lhes põe a disposição.

Applied medical science and technology have now created the conditions where it is possible for infertile couples, who would previously have been condemned not to have children by the usual biological means, to achieve this objective. First, stunning scientific advances in medically assisted reproduction have made it possible to overcome infertility arising from insufficient ovulation or low sperm-count by way of in vitro fertilization. Secondly, the embryo thus produced can now be implanted in another womanïs uterus. This surrogate pregnancy has given rise to a number of ethical, religious and legal questions. On the one hand, the law has a relatively benign view of this practice-so long as it remains within the context of the conventional family structure. Likewise ethics has already marked out the stages in this process. Religious leaders, however, remain deeply opposed and unwilling to enter into dialogue on the issue. Although Brazil is the largest Catholic country in the world, increasing numbers of couples in this country are taking advantage of this new scientific resource, even though they are aware that it conflicts with official religious doctrine. Bioethical debate of this issue has only recently begun and needs to bear in mind the extent to which reproductive technology involves new groups who are not covered by the classical definition of the nuclear family.

Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do vírus linfotrópico de células T humanas em sistema procarioto / Cloning and expression of the transmembranic glycoprotein from human T cell lymphotropic virus in a prokaryotic system

O HTLV-1 é o vírus causador da leucemia/linfoma de célula T no adulto e de uma desordem neurológica conhecida por mielopatia associada ao HTLV ou paraparesia espástica tropical. Um dos modos de transmissão é pelo sangue contaminado e seus subprodutos e, devido ao risco de infecções associadas ao HTLV sua pesquisa na triagem de doadores de sangue foi introduzida no Brasil a partir de 1993. Os kits diagnósticos utilizados nos bancos de sangue nacionais são na sua maioria comprados de empresas estrangeiras. O Brasil não detém a tecnologia para produção deste material e há a necessidade de produção de sistemas de diagnóstico com tecnologia nacional. Neste trabalho, mostramos a expressão da gp21/HTLV-1 em Escherichia coli e sua reatividade frente a anticorpos monoclonais e de pacientes infectados. Expressar tais proteínas é o primeiro passo para obtenção de conjuntos diagnósticos com tecnologia brasileira.

HTLV-1 is the virus that causes T cell lymphoma/leukemia in adults and a neurological disorder known as HTLV-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis. One of the transmission means is through contaminated blood and its byproducts. Because of the risk of HTLV-associated infections, screening for HTLV was introduced for Brazilian blood donors in 1993. Most of the diagnostic kits used in the national blood banks are bought from foreign companies. Brazil does not have the technology to produce this material and there is a need to produce diagnostic systems with national technology. In this study, we show the expression of gp21/HTLV-1 in Escherichia coli and its reactivity towards monoclonal antibodies and the antibodies of infected patients. Expressing these proteins is the first step towards obtaining diagnostic kits with Brazilian biotechnology.

Development of a transformation system for Penicillium brevicompactum based on the Fusarium oxysporum nitrate reductase gene

Penicillium brevicompactum is a filamentous fungus that presents a potential for industrial use due its efficient pectinase production. A heterologous transformation system was developed for P. brevicompactum based on the complementation of a nitrate reductase mutant. Nitrate reductase mutants were obtained by resistance to chlorate in a rate of 23.24% when compared to other mutations that lead to the chlorate resistance. One mutant named 4457-18X was chosen for the transformation experiments with the pNH24 vector containing de Fusarium oxysporum nitrate reductase gene. A frequency of approximately 3 transformants/µg DNA was obtained using the circular vector pNH24. This frequency was multiplied about 10 fold using the linearized vector with the Xba I restriction enzyme. Southern analysis of the transformants showed a tendency of the linearized vector to diminish the number of integrations compared to the use of the circular vector. The integration was random and stable in the analyzed transformants. The establishment of a transformation system for P. brevicompactum is fundamental for genetic manipulation of this microorganism.

Penicillium brevicompactum é um fungo filamentoso que apresenta um potencial para a aplicação industrial devido a sua eficiente produção de enzimas do complexo pectinolítico. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema de transformação heterólogo para P. brevicompactum baseado na complementação de um mutante nitrato redutase. Mutantes nitrato redutase foram obtidos pela resistência ao clorato de sódio em uma taxa de 23,24%. O mutante denominado 4457-18X foi escolhido para os experimentos de transformação com o vetor pNH24, que contém o gene da nitrato redutase de Fusarium oxysporum. Uma freqüência de cerca de 3 transformantes/mg de DNA foi obtida utilizando-se o vetor pNH24 na forma circular e um aumento de cerca de 10 vezes nessa freqüência foi alcançado com a utilização desse vetor linearizado com a enzima de restrição Xba I. A análise dos transformantes pela técnica de hibridização revelou uma tendência do vetor linearizado diminuir o número de integrações em relação ao vetor circular. A integração foi aleatória e estável nos transformantes analisados. O estabelecimento de um sistema de transformação para P. brevicompactum é essencial para a manipulação genética desse microrganismo.