Microalgae protoplasts isolation and fusion for biotechnology research / Aislamiento y fusión de protoplastos de microalgas para aplicaciones biotecnológicas

ABSTRACT Protoplasts are microbial or vegetable cells lacking a cell wall. These can be obtained from microalgae by an enzymatic hydrolysis process in the presence of an osmotic stabilizer. In general, protoplasts are experimentally useful in physiological, genetic and biochemical studies, so their acquisition and fusion will continue to be an active research area in modern biotechnology. The fusion of protoplasts in microalgae constitutes a tool for strain improvement because it allows both intra and interspecific genetic recombination, resulting in organisms with new or improved characteristics of industrial interest. In this review we briefly describe the methodology for obtaining protoplasts, as well as fusion methods and the main applications of microalgal platforms.

RESUMEN Los protoplastos son células microbianas o vegetales que carecen de pared celular. Estos pueden obtenerse a partir de microalgas por un proceso de hidrólisis enzimática en presencia de un estabilizador osmótico. En general, los protoplastos son experimentalmente útiles en estudios fisiológicos, genéticos y bioquímicos, por lo que su obtención y fusión continuarán siendo un área de investigación activa en la biotecnología moderna. La fusión de protoplastos en microalgas constituye una herramienta para el mejoramiento de cepas pues permite la recombinación genética intra e interespecífica, logrando así organismos con nuevas características de interés industrial. En esta revisión, describimos brevemente la metodología para obtener protoplastos, métodos de fusión y las principales aplicaciones de las plataformas basadas en microalgas.

La ruta de señalización de MAPK Pmk1p y el mantenimiento de la integridad celular del Schizosaccharomyces Pombe / The signaling pathway of MAPK Pmk1p and the maintenance of cellular integrity of the Schizosaccharomyces Pombe

En Schizosaccharomyces pombe se han descrito tres cascadas de MAPKs: la de respuesta feromonas, con Spk1p como MAP kinasa; la de respuesta a estrés en la que Sty1p/Spc1p es la MAPK y la de mantenimiento de la integridad celular liderada por Pmk1p/Spm1p. La eliminación de cualquiera de las kinasas de la ruta de integridad provoca alteraciones morfo-lógicas y células multitabicadas en condiciones de estrés. Todos estos defectos sugieren una función en homeostasis iónica y en la biosíntesis de la pared celular por lo que nos propone-mos estudiar el papel de la ruta de señalización de MAPK Pmk1p en el mantenimiento de la integridad celular en S.pombe. En este trabajo el organismo mayoritariamente utilizado ha sido la levadura de fisión S. pombe y para realizar los trabajos de clonación molecular se utili-zaron también diferentes estirpes de Escherichia coli. Se emplearon diversas técnicas de clonación molecular, métodos genéticos, Western Blot y determinación de la actividad de Pmk1p bajo condiciones de estrés. Las conclusiones más importantes fueron: que los "senso-res" "Mtl2p y Wsc1p" señalizan hacia Rho1p, pero no son componentes "auténticos" de la cascada, y sus mutantes no presentan el fenotipo VIC (viable en presencia de inmunosupresor y de iones cloruro), característico de los mutantes en los componentes de la cascada. Mtl2p y Wsc1p no desempeñan un papel importante en la señalización en respuesta a estrés osmótico y daño en la pared celular a través de la ruta de integridad celular de Pmk1p.

Three cascades of MAPKs have been described about the Schizosaccharomyces pombe such as: the pheromone response with Spk1p as MAP kinase, the stress response in which Sty1p/Spc1p is MAPK, and the maintenance of cell integrity led by Pmk1p/Spm1p. The elimination of any of the kinases of the integrity path causes morphological alterations and multitabicated cells under stress conditions; suggesting a role in ionic homeostasis and cell wall biosynthesis. So, it was proposed to study the role of the MAPK Pmk1p signaling pathway in the maintenance of cell integrity in S.pombe. The organism mainly used was the fission yeast S. pombe and different molecular strains of Escherichia coli were used to carry out the molecular cloning work. Different techniques of molecular cloning, genetic methods, Western Blot and determination of the activity of Pmk1p under stress conditions were used. The most important conclusions were that the "sensors" "Mtl2p and Wsc1p" signal towards Rho1p but they are not "authentic" components of the cascade, and their mutants do not present the Vic phenotype (viable in the presence of immunosuppressant and chloride ion), characteristic of the mutants in the components of the cascade. Mtl2p and Wsc1p do not play an important role in signaling in response to osmotic stress and cell wall damage through the cellular integrity pathway of Pmk1p.

Caracterización de indicadores de la calidad del fruto en líneas de fresa transgénicas con genes silenciados que codifican para enzimas pectinolíticas / Characterization of quality traits in transgenic strawberry fruits with genes encoding pectinolytic enzymes down-regulated

RESUMEN Se han evaluado algunos indicadores de calidad del fruto en líneas transgénicas de fresa con los genes de poligalacturonasa FaPGI (líneas PG) o pectato liasa FaplC (líneas APEL) silenciados. Se analizaron dos líneas independientes por genotipo transgénico. No se observaron diferencias en el contenido de sólidos solubles entre las líneas transgénicas y el control. De igual forma, la acidez total y el pH fueron similares en las líneas PG29, APEL21 y el control; sin embargo, la acidez de los frutos de las líneas PG62 y APEL39 fue superior al control. Los parámetros de color L*, a* y b* fueron similares en todos los genotipos; sin embargo, el contenido en antocianos fue menor en la línea APEL21. Los valores más altos de firmeza de fruto, estimada mediante un ensayo de extrusión, se observaron en las dos líneas transgénicas PG y en la línea APEL39. En cuanto a las pérdidas por goteo (drip loss), la línea APEL39 presentó un valor mayor que el control, pero la línea APEL21 registró valores menores. El contenido de compuestos fenólicos se analizó en la línea PG29, no encontrándose diferencias estadísticas con respecto al control. Finalmente, la capacidad del fruto para captar radicales libres fue ligeramente menor en la línea PG29 que en el control. Los resultados indican que el silenciamiento de los genes de pectinasas incrementa significativamente la firmeza de la fresa sin modificar sustancialmente parámetros de calidad del fruto maduro como color, acidez, sólidos solubles o contenido en antocianos.

ABSTRACT Some quality traits of transgenic strawberry fruits with low levels of expression of the pectinase genes FaPGI (PG lines) or FaplC gene (APEL lines) were evaluated. Two independent lines per transgenic genotype were analyzed. Soluble solids were similar in control and transgenic lines. Similarly, pH and titratable acidity was similar in lines PG29, APEL21 and control; however, lines PG62 and APEL39 showed acidity values higher than the control. The color parameters L*, a* and b* were similar in control and transgenic fruits; however, line APEL21 displayed a lower value of anthocyanin content. The highest values of fruit firmness, measured with an extrusion test, were observed in both PG transgenic lines and in the APEL39 line. Regarding the drip loss, APEL39 line showed a higher value than the control, but the APEL21 line displayed lower values. The content of phenolic compounds was analyzed in line PG29, not observing significant differences with the control. Finally, the antiradical activity of the fruit was slightly lower in the line PG29 than in the control. The results obtained indicate that the silencing of the pectinase genes increases the firmness of the fruit without substantially modifying other quality parameters such as color, acidity, soluble solids or anthocyanin content.

Eficacia de un aditivo de levadura en cerdas jóvenes que consumen piensos contaminados con zearalenona / Efficacy of a yeast additive to mitigate the effects of zearalenone-contaminated feed in gilts / Eficácia de um aditivo de levedura para leitoas que consomem ração contaminada por zearalenona

Resumen Antecedentes: Las micotoxinas representan pérdidas económicas significativas para la industria porcina, por lo que los adsorbentes de pared celular de levadura son una alternativa para reducir este problema. Objetivo: Evaluar la eficacia de un aditivo anti-micotoxinas (AAM; Safmannan®) en la prevención de micotoxicosis resultante de la ingesta de zearalenona (ZEA). Métodos: Fueron utilizadas 36 hembras porcinas jóvenes, cuyas dietas incorporaron dos niveles de inclusión del AAM (basado en la pared celular de Saccharomyces cerevisiae; 0 y 0,2%) y tres niveles de inclusión de ZEA (0, 0,25 y 0,6 ppm). El ensayo tuvo una duración total de 21 d, durante los cuales se efectuaron evaluaciones semanales de peso corporal, ganancia de peso, consumo de alimento y el volumen de la vulva. Igualmente, se midieron los pesos relativos de hígado, tracto reproductivo total y el conjunto útero-ovario-vagina. Resultados: Los resultados obtenidos comprueban la eficacia del AMA utilizado, toda vez que su suplementación evitó los efectos tóxicos de ZEA y mejoró los índices en órganos reproductivos como el volumen de la vulva, peso relativo del tracto reproductivo y el conjunto útero-ovario-vagina en animales intoxicados. Sin embargo, los efectos anti-micotoxinas fueron fijos para ambos niveles (0,25 y 0,6 ppm) de ZEA. Conclusión: La adición de AAM en las dietas que contienen ZEA demostró ser una alternativa eficiente para reducir los efectos tóxicos de esta micotoxina.

Abstract Background: Mycotoxins are a significant cause of economic losses in swine farming and adsorbents based on yeast cell walls provide an alternative solution to reducing this challenge. Objective: To evaluate the efficacy of an antimycotoxin additive (AMA; Safmannan®) for preventing the toxic effects of zearalenone (ZEA). Methods: A total of 36 pre-pubertal gilts were used, whose diets consisted of two different levels of AMA (based on the yeast cell wall of Saccharomyces cerevisiae; 0 and 0.2%) and three inclusion levels of ZEA (0, 0.25, and 0.6 ppm). The experiment was conducted for a period of 21 d and the following parameters were measured weekly: Live weight, weight gain, feed intake, and vulvar volume. The relative weight of the liver and the entire reproductive tract, including the uterus-ovary-vagina combined were also measured. Results: There was a significant enhancement in the index characteristics of reproductive organs like vulvar volume, weight of the entire reproductive tract and weight of the uterus-ovary-vagina of the intoxicated animals. The antimycotoxin effects were the same, irrespective of the ZEA levels (0.25 and 0.6 ppm). Conclusion: The addition of AMA to diets containing ZEA proved to be an effective alternative for reducing the toxic effects of this mycotoxin.

Resumo Antecedentes: As micotoxinas determinam perdas econômicas importantes para suinocultura e os adsorventes à base de parede celular de leveduras são uma alternativa para reduzir este problema. Objetivo: Avaliar a eficácia de um aditivo anti-micotoxina (AAM; Safmannan®) na prevenção da micotoxicose decorrente da ingestão de zearalenona (ZEA). Métodos: Foram utilizadas 36 leitoas pré-púberes, cujas dietas apresentaram dois níveis de inclusão de AAM (à base de parede celular de Saccharomyces cerevisiae; 0 e 0,2%) e três níveis de inclusão de ZEA (0, 0,25 e 0,6 ppm). O período experimental teve duração total de 21 d, sendo realizadas avaliações semanais de peso vivo, ganho de peso, consumo de ração e volume vulvar. Pesos relativos de fígado, trato reprodutivo total e o conjunto útero-ovário-vagina também foram calculados. Resultados: Os resultados obtidos demonstram a eficácia do AAM, pois a sua inclusão demonstrou prevenir os efeitos tóxicos da ZEA, já que os índices em órgãos reprodutivos como volume vulvar, peso relativo do trato reprodutivo total e do conjunto útero-ovário-vagina foram maiores nos animais intoxicados e sem suplementação. Porém, o efeito anti-micotoxina foi fixo, sendo o mesmo para os dois níveis de ZEA (0.25 e 0.6 ppm). Conclusão: A adição do AAM em questão nas dietas contendo ZEA demonstrou ser uma alternativa eficiente para redução dos efeitos tóxicos desta micotoxina.

Crecimiento in vitro y producción de enzimas degradadoras de pared celular vegetal de aislamientos argentinos de Macrophomina phaseolina, agente causal de la podredumbre carbonosa en maíz / In vitro growth and cell wall degrading enzyme production by Argentinean isolates of Macrophomina phaseolina, the causative agent of charcoal rot in corn

Macrophomina phaseolina is a polyphagous phytopathogen, causing stalk rot on many commercially important species. Damages caused by this pathogen in soybean and maize crops in Argentina during drought and hot weather have increased due its ability to survive as sclerotia in soil and crop debris under non-till practices. In this work, we explored the in vitro production of plant cell wall-degrading enzymes --#91;pectinases (polygalacturonase and polymethylgalacturonase); cellulases (endoglucanase); hemicellulases (endoxylanase) and the ligninolytic enzyme laccase--#93; by several Argentinean isolates of M. phaseolina, and assessed the pathogenicity of these isolates as a preliminary step to establish the role of these enzymes in M. phaseolina-maize interaction. The isolates were grown in liquid synthetic medium supplemented with glucose, pectin, carboxymethylcellulose or xylan as carbon sources and/or enzyme inducers and glutamic acid as nitrogen source. Pectinases were the first cell wall-degrading enzymes detected and the activities obtained (polygalacturonase activity was between 0.4 and 1.3 U/ml and polymethylgalacturonase between 0.15 and 1.3 U/ml) were higher than those of cellulases and xylanases, which appeared later and in a lesser magnitude. This sequence would promote initial tissue maceration followed by cell wall degradation. Laccase was detected in all the isolates evaluated (activity was between 36 U/l and 63 U/l). The aggressiveness of the isolates was tested in maize, sunflower and watermelon seeds, being high on all the plants assayed. This study reports for the first time the potential of different isolates of M. phaseolina to produce plant cell wall-degrading enzymes in submerged fermentation.

Macrophomina phaseolina es un fitopatógeno polífago, causante de podredumbre carbonosa. Los daños que genera en cultivos de soja y maíz bajo siembra directa en Argentina, en períodos secos y calurosos, se incrementaron por su habilidad para sobrevivir como esclerocios en suelos y restos de cosecha. El propósito del trabajo fue estudiar la producción in vitro de enzimas degradadoras de pared celular vegetal (pectinasas --#91;poligalacturonasa y polimetilgalacturonasa--#93;; celulasas --#91;endoglucanasa--#93;; hemicelulasas --#91;endoxilanasa--#93; y la enzima ligninolítica lacasa) de varios aislamientos argentinos de M. phaseolina y evaluar la patogenicidad de esos aislamientos, como paso preliminar para establecer el papel de estas enzimas en la interacción M. phaseolina-maíz. Se estudió la cinética de crecimiento del hongo y la de la producción de dichas enzimas en medios de cultivo líquidos sintéticos con ácido glutámico como fuente de nitrógeno y con pectina, carboximetilcelulosa (CMC) o xilano como fuentes de carbono. Las pectinasas fueron las primeras enzimas detectadas y los máximos títulos registrados (1,4 UE/ml --#91;poligalacturonasa--#93; y 1,2 UE/ml --#91;polimetilgalacturonasa--#93;, respectivamente) superaron a los de celulasas y xilanasas, que aparecieron más tardíamente y en menor magnitud. Esta secuencia promovería la maceración inicial del tejido, seguida luego por la degradación de la pared celular vegetal. Se detectó actividad lacasa en todos los aislamientos (36 a 63 U/l). La agresividad de todos los aislamientos resultó alta en los 3 hospedantes evaluados: semillas de maíz, de girasol y de melón. En este trabajo se investiga por primera vez el potencial de distintos aislamientos de M. phaseolina para producir enzimas degradadoras de pared celular vegetal en cultivo líquido.

Evaluation of a mycotoxin adsorbent in swine diets containing barley naturally contaminated with Fusarium mycotoxins / Evaluación de un adsorbente de micotoxinas en dietas para cerdos que contienen cebada contaminada naturalmente con micotoxinas de Fusarium / Avaliação de um adsorvente de micotoxinas em suínos dieta contendo cevada naturalmente contaminado com micotoxinas Fusarium

Summary Background: contamination of barley with Fusarium mycotoxins causes significant economic losses for pork producers, and alleviation with mycotoxin sequestering agents has proven inconsistent. Objective: to evaluate a yeast cell wall product in preventing adverse effects of Fusarium mycotoxins on growth performance, blood characteristic, and nutrient digestibility in gilts fed diets containing barley naturally contaminated with Fusarium mycotoxins. Methods: positive and negative controls of corn-soybean meal diets containing 20% control and contaminated barley with Fusarium mycotoxins, respectively, were prepared. Two additional diets were prepared by adding 0.2 or 0.4% of a yeast cell wall product to the negative control diet. The experimental diets were fed to pigs with 61.7 Kg initial body weight for 2 weeks. Results: pigs fed the negative control diet gained less than those fed the positive control diet (p<0.05) from d 0 to 7 and during the overall period, but nutrient digestibility and blood characteristics were not affected by feeding the contaminated diet. Most measurements were not affected by supplementing the yeast cell wall to the negative control diet. Conclusion: addition of the yeast cell wall product to negative control diets failed to ameliorate the adverse effects of dietary Fusarium mycotoxin on growth performance.

Resumen Antecedentes: la contaminación de la cebada con micotoxinas de Fusarium causa importantes pérdidas económicas para los productores de carne de cerdo, pero adsorbentes de micotoxinas para prevenir los efectos perjudiciales de las micotoxinas no dieron resultados consistentes. Objetivo: evaluar el producto de la pared celular de la levadura en la prevención de los efectos adversos de las micotoxinas de Fusarium sobre el crecimiento, características de la sangre, y la digestibilidad de nutrientes en cerdas jóvenes alimentadas con dietas que contienen cebada naturalmente contaminada con micotoxinas de Fusarium. Métodos: se prepararon las dietas a base de harina de maíz-soja de control positivo y negativo contienen 20% de control y cebada contaminados con micotoxinas de Fusarium, respectivamente. Adicionalmente se prepararon 2 dietas con productos de la pared celular de levadura de 0,2 o 0,4% a la dieta de control negativo. Fueron alimentados con las dietas experimentales cerdos con un peso corporal inicial de 61,7 Kg durante 2 semanas. Resultados: los cerdos alimentados con la dieta control negativo ganaron menos que aquellos alimentados con la dieta control positivo (p<0,05) a partir del d 0 a 7 y durante el período en general, pero la digestibilidad de los nutrientes y características de la sangre no fueron afectados por la alimentación de la dieta contaminada. La mayoría de las mediciones no fueron afectadas por la suplementación de la pared celular de la levadura con la dieta control negativo. Conclusión: la adición del producto de pared celular de levadura a la dieta control negativo no logró aminorar los efectos adversos de las micotoxinas de Fusarium sobre el crecimiento.

Resumo Antecedentes: a contaminação da cevada com a micotoxinas Fusarium causa perdas econômicas significativas para os produtores de suínos, porèm os adsorventes de micotoxinas que evitam efeitos prejudiciais de micotoxinas não deram resultados consistentes. Objetivo: avaliar o produto da parede celular das leveduras para prevenir efeitos adversos da micotoxinas Fusarium no desempenho do crescimento, inchaço da vulva, característica do sangue, digestibilidade dos nutrientes em porcas jòvens que são alimentadas com dietas contendo a cevada naturalmente contaminada com micotoxinas do Fusarium. Métodos: foram preparadas dietas de controle positivo e negativo à base de milho e soja, contendo 20% do controle e cevada contaminada com micotoxinas Fusarium, respectivamente. Duas dietas adicionais foram preparadas complementando com 0,2 ou 0,4% o produto da parede celular das leveduras à dieta do controle negativo. As dietas experimentais foram fornecidas aos suínos com peso corporal inicial de 61,7 Kg por 2 semanas. Resultados: os suínos alimentados com a dieta do controle negativo ganharam menos peso do que aqueles alimentados com a dieta do controle positivo (p<0,05) a partir do dia 0 até 7 durante todo o período, a digestibilidade dos nutrientes e as características do sangue não foram afetadas pela alimentação da dieta contaminada. A maioria das medidas não foram afetadas pela complementação da parede celular das leveduras à dieta do controle negativo. Conclusão: a complementação do produto da parede celular das leveduras nas dietas de controle negativo não conseguiu melhorar o efeito adverso das micotoxinas Fusariume no desempenho de crescimento.

Micromorfologíayy histoquímica de los laticífers de órganos vegetativos de esppecies de asclepiadoideae (apocynaceae) / Micromorphology and Histochemistry of the Laticifers from Vegetative Organs of Asclepiadoideae species (Apocynaceae)

La micromorfología y las principales clases de componentes de las paredes de los laticíferos y del látex de Asclepias curassavica, Fischeria stellata, Gonioanthela axillaris, Matelea denticulata y Oxypetalum banksii, fueron analizadas y comparadas con las de especies de Apocynaceae de Cerrado. Los laticíferos de las especies estudiadas de diferentes tipos de bosques presentan características semejantes. Las paredes son primarias, altamente hidratadas, pecto-celulósicas y fuertemente adheridas a las paredes de las células adyacentes. El látex es blanco lechoso, constituido por polisacáridos, incluyendo mucílago, proteínas, lípidos, incluyendo ácidos grasos, compuestos fenólicos e alcaloides. Fischeria y Gonioanthela difieren de las demás especies por producir lípidos neutros. El látex de las especies investigadas está asociado a la protección de la planta contra herbivoría, pudiendo ser tóxico e inhibir la proliferación de microorganismos, además de coagular, sellando heridas de las plantas y funcionando como barrera física. Estas propiedades del látex proporcionan una mayor ventaja adaptativa a estas plantas en relación a las no latescentes.

Micromorphology and main substances of the laticifer walls and latex of Asclepias curassavica, Fischeria stellata, Gonioanthela axillaris, Matelea denticulata, and Oxypetalum banksii were analyzed and compared with those of Apocynacean Cerrado species. Laticifers of the studied species from different rainforest vegetations exhibit similar features. The walls are primary, highly hydrated, pectic-cellulosic, and firmly attached to adjacent cell walls. The latex is milky white, constituted by polysaccharides, including mucilage, proteins, lipids, including fatty acids, phenolic compounds, and alkaloids; however, Fischeria and Gonioanthela differ from the other species for also producing neutral lipids. The latex of the investigated species is related to plant defense against herbivory, and may be toxic and inhibit microorganism proliferation. Also, it can coagulate, sealing plants wounds and working as a physical barrier. These latex properties provide greater adaptive advantage to these plants in relation to non-latescent plants.