Decontamination of genetically modified mice strains by embryo transfer for obtaining SPF colonies in a Brazilian animal facility / Descontaminação de linhagens de camundongos geneticamente modificadas por transferência embrionária para obtenção de colônias SPF em um biotério brasileiro (São Paulo, SP)

The introduction of new strains of mice in specific pathogen-free (SPF) animal facilities should be performed carefully to avoid breaking sanitary barriers. To meet this need, animals should be rederived to reduce infection risk and thus avoid research interference caused by loss of animal health status and welfare. The objective of this study was to implement mice embryo transfer in the laboratory mouse facility of the Department of Immunology at the Institute of Biomedical Sciences/University of São Paulo, Brazil. Embryo transfers were performed to rederive genetically modified mouse strains with undefined sanitary status, received from different research and educational institutions. Fertilized eggs at two-cell stage were obtained by natural means and transferred into the oviducts of SPF pseudo-pregnant female mice. All surgical procedures were performed under aseptic conditions. A total of 625 embryos were transferred into the recipients. 148 pups were born, of which 140 were reared. Viruses, bacteria and intestinal protozoa were eliminated using this technique. The improvement in the microbiological status of mice allowed their expansion in our SPF facility. With these results, we can stimulate the use of embryo transfer technique between rodent facilities in Brazil and thus encourage the distribution of better models to our scientific community.(AU)

A introdução de novas linhagens de camundongos em biotérios livres de patógenos específicos (SPF) deve ser realizada com critérios para evitar a quebra das barreiras sanitárias. Dessa forma, os animais devem ser rederivados para reduzir os riscos de infecção e evitar as interferências provocadas pela perda do status sanitário e do bem-estar dos animais. O objetivo deste estudo foi implementar a transferência de embriões murinos no Biotério do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, Brasil. As transferências embrionárias foram realizadas para rederivar linhagens de camundongos geneticamente modificadas com status sanitário não conhecido, recebidas de diferentes instituições de pesquisa e de ensino. Os embriões em duas células foram obtidos pelos métodos naturais e transferidos para os ovidutos de fêmeas de camundongos SPF pseudoprenhas. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Um total de 625 embriões foram transferidos para as receptoras. Foram obtidos 148 filhotes nascidos vivos, destes 140 foram desmamados. Por meio desta técnica, foram eliminados vírus, bactérias e protozoários intestinais. A melhora no status microbiológico dos camundongos permitiu a expansão destes em nossa colônia SPF. Com esses resultados, podemos promover o uso da técnica de transferência de embriões entre os biotérios brasileiros e assim incentivar a distribuição de modelos mais adequados para a nossa comunidade científica.(AU)

Avaliação do extrato etanólico de casca de Punica granatum (romã) na diminuição da replicação viral do BoHV-1 Colorado em embriões murinos experimentalmente infectados / Evaluation of ethanol extract of Punica granatum (Pomegranate) peel decrease in viral replication of BoHV-1 in Colorado murine embryos experimentally infected

O objetivo do trabalho foi avaliar a diminuição da replicação viral (BoHV-1 Colorado) em embriões murinos após tratamento do extrato etanólico da casca de Punica granatum (EEPg). Camundongos fêmeas Swiss com idade entre 6 e 8 semanas foram superovuladas com 0,2 mL a 5 UI de hormônios (eCG e hCG), e acasaladas com machos da mesma idade. Após 18 horas, as fêmeas sofreram eutanásia em câmara de CO2 e, através de abertura no peritônio, os zigotos foram coletados e lavados com solução de pronase 0,5%.Os zigotos foram divididos em quatro grupos: G1 (controle), G2 (expostos aos vírus BoHV-1 Colorado a 108 TCID50/mL), G3 (expostos ao EEPg) e G4 (expostos aos vírus e ao EEPg). Os grupos foram mantidos a 37,5ºC em meio TCM199 (100µL) com 10% de soro fetal bovino em estufa a 5% de CO2 e 95% de umidade. Após 24 h, analisamos a taxa de clivagem (teste exato de Fisher; p<0,05), a morfologia (por microscopia óptica), a nested-PCR e a titulação dos embriões em cocultura com células MDBK após mais 72 h do tratamento (teste de Mann-Whitney; p<0,05) e microscopia eletrônica de transmissão (ME). Os embriões murinos tratados com EEPg apresentaram resultados satisfatórios: sem alterações morfológicas, taxa de clivagem semelhante ao controle e, apesar da detecção da presença do vírus pela nested-PCR e ME, houve diminuição do título viral após tratamentos com esse extrato, o que sugere interferência desse tratamento no ciclo viral do BoHV-1 Colorado sem alterar o desenvolvimento dos embriões.(AU)

The aim of this study was to evaluate the reduction of viral replication (Colorado BoHV-1) in murine embryos after the treatment of ethanol extract of Punica granatum peel (PgEE). Swiss female mice aged 6 to 8 weeks were superovulated with 0.2 mL of the 5 UI hormones (eCG and hCG) and mated with males of the same age. After 18 hours, the females were euthanized in a CO2 chamber, and through the opening in the peritoneum, zygotes were collected and washed with 0.5% pronase solution. The zygotes were divided into four groups: G1 (control), G2 (exposed to the virus Colorado BoHV -1 to 108 TCID50/mL), G3 (exposed to PgEE) and G4 (exposed to the virus and to PgEE). The groups were maintained at 37.5ºC in TCM199 (100 mL) with 10% fetal bovine serum in an incubator at 5% CO2 and 95% humidity. After 24 h, we analyzed the cleavage rate (Fisher's exact test; p<0.05), the morphology (by light microscopy), the nested-PCR and the titration of embryos in co-culture with MDBK cells after over 72 h of treatment (Mann-Whitney test; p<0.05) and transmission electron microscopy (TEM). The murine embryos treated with PgEE showed satisfactory results: no morphological changes, cleavage rate similar to controls, despite the detection of the presence of virus by nested PCR and TEM, there was a decrease of the viral titer after the treatment with this extract, which suggests interference of this treatment in the viral cycle BoHV-1 Colorado without altering the embryo development.(AU)

Vitrificação de embriões Mus domesticus domesticus contidos em volumes diferentes de 9, 0 M de etileno glicol / Vitrification of Mus domesticus domesticus embryos exposed to differents volumes of 9.0 M ethylene glycol solution

Os experimentos tiveram como objetivo determinar a taxa de eclosão dos embriões vitrificados em volumes diferentes de 9,0M de etileno glicol. Simultaneamente, testaram-se dois procedimentos de estocagem dos fios de teflon, denominados caixade aço inoxidável e globete/raque. No experimento I, os 881 embriões coletados foram distribuídos em 4 tratamentos: tratamento1 (T1 = controle): 307 embriões foram cultivados in vitro em meio PBSm, acrescido de 0,4 por cento de BSA; tratamento 2 (T2): 292embriões foram expostos à solução de glicerol 10 por cento acrescida de 0,4 por cento de BSA, envasados em palhetas de 0,25 mL esubmetidos ao congelamento pelo método rápido em Biocool®; tratamento 3 (T3): 138 embriões foram expostos durante 2minutos à solução de desidratação (10 por cento de EG + 6 por cento BSA em PBSm) e então transferidos para a solução de vitrificação (50 por centode EG + 6 por cento de BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos sendo após transferidos para o volume de 1 µL nointerior de um fio de teflon, medindo 0,4mm de diâmetro, 2,0cm de comprimento e 0,05mm de espessura. Os fios foramacondicionados em uma caixa de aço inoxidável para serem armazenados em nitrogênio líquido; tratamento 4 (T4): 144 embriõesforam expostos à solução de desidratação (10 por cento de EG + 6 por cento BSA em PBSm) e após 2 minutos, foram transferidos para asolução de vitrificação (50 por cento de EG + 6 por cento BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos e foram colocados em volumede 1 µL no interior do fio de teflon. Os fios de teflon foram estocados em globetes unidos às raques e mantidos em nitrogêniolíquido. Após o aquecimento, os embriões foram cultivados em PBSm suplementado com 0,4 por cento de BSA. As taxas de eclosãoembrionária observadas foram: T1=79,80 por cento (245/307); T2=40,07 por cento (117/292); T3=39,13 por cento (54/138) e T4=25,69 por cento (37/144).No segundo experimento 747 embriões foram distribuídos em 3 tratamentos: tratamento 1 (T1= controle): 80 embriões foram...

This work was performed with Mus domesticus domesticus embryos to verify the in vitro viability of vitrified embryos usingdifferents volumes of ethylene glycol-based solution. The experiment I consisted of four treatments. The 881 collected embryoswere arranged as follows: treatment 1 (control): 307 fresh embryos were cultured in vitro in PBSm + 0.4 percent BSA without beingexposed to either dehydration or cryoprotectants agents; treatment 2: 292 embryos were loaded into 0.25 mL french strawscontaining 10 percent glycerol + 0.4 percent BSA in PBSm and after 10 minutes the straws were submitted to the rapid-freezing procedure(Biocool@, controlled freezer); treatment 3:138 embryos were exposed during 2 minutes to a dehydration solution (10 percent ethyleneglycol + 6 percent BSA in PBSm) and then transferred to the vitrification solution (50 percent ethylene glycol + 6 percent BSA in PBSm) in teflon wirewith 0.4 mm diameter, 2cm length and 0.05 mm thickness containing the drop of 1 µL volume, and placed into stainless steelbox for the storage in LN2; treatment 4: 144 embryos were exposed to a dehydration solution (10 percent éthylene glycol + 6 percent BSA inPBSm) and after 2 minutes were transferred to the teflon wire, that was previousily loaded with 1 µL of the vitrification solution (50 percent ethylene glycol + 6 percent BSA in PBSm). Finally, the teflon wires were placed into plastic globets attached to aluminum canesand maintained in LN2. After thawing, the embryos were serially washed in PBSm, and then cultured in PBSm supplementedwith 0.4 percent BSA. The hatched blastocyst rates observed in the treatments were: T1 =79,80 percent (245/307); T2=40,07 percent (117/292);T3=39,13 percent (54/138) and T4=25,69 percent (37/144). In the second experiment, 747 embryos were arranged as follows: treatment 1(control): consisted of 80 fresh embryos cultured in...