Evaluación y caracterización de la sirtuina 2.3 de Giardia duodenalis (CdSir2.3)

La giardiasis es la enfermedad gastrointestinal de mayor incidencia mundial, causada por el protozoario Giardia duodenalis, para la cual no se cuenta con una vacuna o tratamiento eficiente. En aras de buscar nuevos blancos farmacológicos contra este parásito, se han estudiado las enzimas del metabolismo energético, como las sirtuinas, deacetilasas dependientes del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD). Previamente se identificó a GdSir2.1 y GdSir2.2 como deacetilasas dependientes de NAD, con localizaciones subcelulares diferentes. En este trabajo se estudió otro candidato a sirtuina (GdSir2.3) mediante herramientas bioinformáticas para la identificación de características típicas de la familia sirtuina en la secuencia del candidato, y experimentales como la obtención de la proteína recombinante 6xHis-GdSir2.3 que demostró actividad deacetilasa dependiente de NAD y que sirvió como antígeno en la producción de los IgY - α -6xHis-GdSir2.3 para la localización subcelular de la proteína endógena en G. duodenalis. Lo anterior concuerda con otros estudios donde se señala a GdSir2.3 como un importante regulador de la enquistación, debido a su aumento de expresión durante esta etapa del ciclo de vida, constituyéndola como un blanco farmacológico promisorio para el control de esta parasitemia.

Giardiasis is the gastrointestinal disease with the highest incidence worldwide, caused by the protozoan Giardia duodenalis, for which there is no vaccine or efficient treatment. In order to find new pharmacological targets against this parasite, energy metabolism enzymes such as sirtuins, deacetylases dependent on the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), have been studied. GdSir2.1 and GdSir2.2 were previously identified as NAD-dependent deacetylases, with different subcellular locations. In this work, another candidate for sirtuin (GdSir2.3) was studied using bioinformatic tools for the identification of typical characteristics of the sirtuin family in the sequence of the candidate; and experimental ones such as obtaining the recombinant protein 6xHis-GdSir2.3 that demonstrated NAD-dependent deacetylase activity; and that it served as an antigen in the production of IgY - α - 6xHis-GdSir2.3 for the subcellular localization of the endogenous protein in G. duodenalis. The foregoing is consistent with other studies where GdSir2.3 is indicated as an important regulator of encyst due to its increased expression during this stage of the life cycle, constituting it as a promising drug target for the control of this parasitaemia.

A giardíase é a doença gastrointestinal de maior incidência no mundo, causada pelo protozoário Giardia duodenalis, para a qual não existe vacina ou tratamento eficaz. Com o objetivo de encontrar novos alvos farmacológicos contra esse parasita, têm sido estudadas enzimas do metabolismo energético, como as sirtuínas, desacetilases dependentes do dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD). GdSir2.1 e GdSir2.2 foram previamente identificados como desacetilases dependentes de NAD, com diferentes localizações subcelulares. Neste trabalho, outro candidato a sirtuin (GdSir2.3) foi estudado usando ferramentas de bioinformática para a identificação de características típicas da família sirtuin na sequência do candidato; e experimentais, como a obtenção da proteína recombinante 6xHis-GdSir2.3 que demonstrou atividade desacetilase dependente de NAD; e que serviu como antígeno na produção de IgY - α - 6xHis-GdSir2.3 para a localização subcelular da proteína endógena em G. duodenalis. O exposto é consistente com outros estudos em que o GdSir2.3 é apontado como um importante regulador de encisto devido à sua expressão aumentada durante esta fase do ciclo de vida, constituindo-se como um alvo promissor para o controle dessa parasitemia.

Desenvolvimento de inibidores duais de histona desacetilase 6 (HDAC6) e tirosina quinase (TQ) com vistas ao tratamento do câncer / Design of histone deacetylase 6 (HDAC6) and tyrosine kinase (TK) dual inhibitors for cancer treatment

Câncer é a denominação atribuída a um conjunto de doenças que são responsáveis pela segunda maior causa de morte no Brasil e no mundo. A quimioterapia figura entre uma das estratégias utilizadas para o tratamento e cura do câncer, sendo amplamente empregada em estratégias terapêuticas isoladas, ou em associação à radioterapia e cirurgia. A enzima histona desacetilase 6 (HDAC6) é responsável por desacetilar a cadeia lateral de N-acetillisinas em -tubulinas, desempanhando papel crítico na dinâmica do citoesqueleto celular, estando superexpressa em uma série de neoplasias. Neste sentido, na última década os receptores tirosina quinase (TQ) foram os principais alvos de fármacos aprovados para o tratamento do câncer e de doenças autoimunes e continuam atraindo a atenção de grupos de pesquisa dada a exorbitante diversidade do quinoma humano. É sabido que a monoterapia seja com inibidores de HDAC, seja com inibidores TQ, apresenta problemas de toxicidade, reações adversas, ineficácia, resistência e/ou recidiva. Diversos estudos relatam o desenvolvimento de inibidores duais de HDAC-TQ, almejando tanto a simplificação do tratamento, quanto sinergismo terapêutico e redução de efeitos adversos. Assim, o presente trabalho apresenta o planejamento, síntese e avaliação da citotoxicidade de inibidores duais, potencialmente seletivos para HDAC6 e receptores TQ. No total, 23 compostos foram sintetizados entre 2 a 4 etapas. Todos os compostos finais foram caracterizados por RMN (1H e 13C) e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS). A citotoxicidade foi determinada pelo ensaio de MTT, em linhagens derivadas de tumores sólidos (HCT116 e MCF-7) e hematológicos (Jurkat e Namalwa). Os compostos apresentaram citotoxicidade em concentrações micro e nanomolares em todas as linhagens testadas, sendo que a linhagem MCF-7 foi a mais resistente à ação dos compostos, e as linhagens hematológicas foram as mais sensíveis. Os inibidores 4d-f foram os mais ativos na triagem por MTT, com IC50 iguais a 20, 30 e 50 nM, respectivamente, em células Jurkat. Estudos mecanísticos do efeito citotóxico indicaram que os compostos 4d-f exercem atividade de forma tempo-dependente, e majoritariamente por ação antiproliferativa, embora estímulos apoptóticos também tenham sido observados nos estudos. Simulações de ancoramento molecular (docking) e de relação entre as estruturas químicas dos compostos e suas respectivas atividades biológicas (REA) permitiram identificar padrões moleculares, propriedades físico-químicas e eletrônicas que potencialmente possuem relação com a atividade biológica dos compostos, permitindo futuras otimizações do arcabouço molecular desta série de compostos. Tomados em conjunto, os resultados deste trabalho revelam o potencial terapêutico de inibidores duais de HDAC6-TQ. Notadamente, os compostos apresentados aqui podem ser os primeiros potenciais inibidores duais de HDAC6-TQ a serem reportados na literatura

Cancer is the name of a series of diseases that are the second main cause of death in Brazil and worldwide. Chemotherapy is one of the main strategies to treat and cure cancer, and has been widely applied as a single therapeutic agent, and in association with radiotherapy and surgery. Histone deacetylase 6 (HDAC6) deacetylates N-acetyllysine side chains of tubulin, playing crucial role on cytoskeletal dynamics, and could be overexpressed in several cancers. Tyrosine kinase receptors (TK) have been the main targets of FDA-approved drugs through the last decade for both cancer and autoimmune diseases, and have been attracting special attention of research groups due to the exorbitant diversity of the human kinome. It is known that either HDAC or TK single therapy have toxicity issues, adverse effects, inefficacy, resistance and/or recidive. Therefore, many studies report the design of HDAC-TK dual inhibitors aiming simpler treatments, synergism of action and side effects reduction. Herein, the design, synthesis and cytotoxic evaluation of dual and selective HDAC6-TK inhibitors are presented. A total of 23 compounds were designed and synthesized through 2 to 4 steps. All final compounds were characterized by 1H/13C NMR and high-resolution mass spectrometry (HRMS). The cytotoxicity of compounds was determined by MTT assay for both solid (HCT116 and MCF-7 cells) and hematological cancers (Jurkat and Namalwa cells). Compounds exhibited micro and nanomolar ranges of cytotoxicity for all cell lines tested. MCF-7 cells were the most resistant against the treatment, and hematological cells were more susceptible to the cytotoxic effect of the compounds. Compounds 4d-f were the most actives in the MTT screening against Jurkat cells (IC50 = 20, 30 and 50 nM, respectively). Mechanistic studies regarding the cytotoxic effects of 4d-f indicated that the compounds induced cell death in a time-dependent manner mainly via cytostatic activity even though apoptotic stimuli were observed also. Molecular docking and structure-activity relationships (SARs) allowed the identification of molecular patterns, and physicochemical and electronic properties that potentially modulate the biological activity of these compounds, allowing further optimizations of the molecular scaffold for these series of compounds. Taken together, the results of this study reveal the therapeutic potential of HDAC6-TK dual inhibitors. Noteworthy, the compounds reported herein could be the first HDAC6-TK dual inhibitors ever reported in literature

Planejamento, síntese, modelagem molecular e avaliação biológica de novos potenciais inibidores duais HDAC/ MMP não-hidroxamatos / Design, synthesis, molecular modeling and biological evaluation of novel potential non-hydroxamate dual HDAC/ MMP inhibitors

A inibição de alvos específicos como metaloproteinase de matriz (MMP) e histona desacetilase (HDAC) é amplamente estudada para impedir o progresso do câncer. Foi estabelecido que a inibição concomitante de MMP e HDAC é eficaz no combate de tumores sólidos e hematológicos. Ambos os alvos possuem um íon Zn2+ em seu sítio ativo, fundamental para a atividade destas enzimas. A alta afinidade dos inibidores conhecidos de MMP e de HDAC é conferida, principalmente, por um potente grupo ligante de zinco (ZBG). O ácido hidroxâmico é o ZBG mais potente conhecido atualmente, entretanto, este apresenta instabilidade farmacocinética, levando a ineficácia e genotoxicidade em testes clínicos. Frente a este contexto, o presente trabalho teve como objetivo o planejamento, síntese, modelagem molecular e avaliação biológica de novos inibidores duais MMP/HDAC não-hidroxamatos. Os compostos foram planejados utilizando estratégias de hibridação molecular, a partir de arcabouços provenientes inibidores de HDAC e MMP, gerando compostos arilsulfonamídicos com variações no tipo de ZBG inserido e na sua respectiva posição relativa na estrutura geral. Foram sintetizados sete análogos, em duas a três etapas reacionais, utilizando métodos de sulfonilação e acoplamento com agentes condensantes, partindo dos ésteres para e meta aminobenzoicos. Os rendimentos globais variaram de 25% a 55% e os produtos obtidos foram caracterizados por RMN 1H e 13C, LC/MS, CLAE e ponto de fusão. Os compostos tiveram sua atividade citotóxica avaliada em células HOG (oligodendroma) e T98G (glioblastoma), dentre os quais o 6a, que possui o ZBG 2-amino anilida, foi o mais promissor, apresentando atividade nas duas linhagens na casa de nM. Ensaios de coordenação com Fe2+ comprovaram a capacidade quelante dos análogos contendo ácido hidroxâmico e dos demais compostos citotóxicos, 4a e 4b (ZBG-2, salicilal-hidrazona), o que não foi observado para o composto 6a. Os estudos de ancoramento molecular permitiram sugerir um modo de interação para todos os ZBG propostos frente aos respectivos alvos (HDAC e MMP), sendo observado que o ZBG 4 (2-amino anilida) faria a interação de modo monodentado com a HDAC, enquanto não seria possível o encaixe no sítio catalítico da MMP. Conclui-se, portanto, que o planejamento proposto permitiu a obtenção de compostos promissores como antitumorais, e que a substituição do ácido hidroxâmico por outros ZBG fornece moléculas ativas frente a células tumorais. Entretanto, a avaliação biológica frente à MMP e HDAC é necessária para confirmar o mecanismo de ação proposto

Inhibition of specific targets such as matrix metalloproteinase (MMP) and histone deacetylase (HDAC) is extensively studied regarding arrest cancer growth. Particularly, concomitant inhibition of MMP and HDAC is effective against solid and hematologic tumors. Both targets have an ion Zn2+ at their catalytic site, which is essential for respective enzymatic activity. High affinity of known MMP and HDAC inhibitors is mainly provided by a potent zinc binding group (ZBG). Hydroxamic acid is the most potent ZBG currently known; however, it presents low pharmacokinetics stability, which results in its ineffectiveness and genotoxicity along clinical trial. So, the aim of this work comprised the design, synthesis, molecular modeling and biological evaluation of novel potential non-hydroxamate dual HDAC/ MMP inhibitors. Compounds were designed by molecular hybridation, employing scaffolds from HDAC and MMP inhibitors, which provided arylsulfonamides with variation about the ZBG type and its respective relative position in the general structure. Seven compounds were synthesized, in two to three reaction steps, through methods that comprise sulfonilation and coupling with condensing agents, using para and meta-aminobenzoic esters as starting material. Compounds showed global yields around 25-55 % and were characterized by 1H and 13C NMR, LC/MS, HPLC and melting point. Compounds were evaluated about their cytotoxicity against HOG (oligodendroma) and T98G (glioblastoma) cells, which 6a, with ZBG 2-aminobenzamide, was the most promising molecules, presenting activity against both cell lines at nM range. Coordination assays with Fe2+ proved the chelating capacity of hydroxamate analogues as well as the cytotoxic compounds, 4a and 4b (ZBG-2, salicylal-hydrazone), which was not observed about 6a. Molecular docking allowed to suggest an interaction model for all proposed ZBG with the respective targets (MMP and HDAC), showing that (ZBG-4) 2-aminobenzamide interacts with HDAC by monodentate way, but does not docks at MMP catalytic site. We conclude that the proposed design allowed obtaining promising compounds as antitumors agents, and the replacement of hydroxamic acid by other ZBG provide active molecules against tumor cells. However, biological evaluation against MMP and HDAC is necessary to confirm the proposed action mechanism

Evaluation of the melting temperature of TaqMan probes as a genotyping method for IDH1, IDH2, and H3F3A in pediatric astrocytomas / Evaluación del método de temperatura de disociación de sondas TaqMan para la genotipificación de IDH1, IDH2 y H3F3A en astrocitomas pediátricos

Abstract Background: Astrocytomas are cancer tumors of the central nervous system and represent the most common type of solid tumors during human childhood. In 2016, the World Health Organization established a molecular classification system to regroup tumor entities to achieve a more accurate diagnosis and a better clinical decision-making and selection of treatment in patients with these types of tumors. Methods: We evaluated a genotyping assay for rapid and cost-effective mutation detection in astrocytomas using TaqMan probes in an asymmetric polymerase chain reaction (PCR) assay. Results: Four diffuse astrocytomas (Grade II), three anaplastic astrocytomas (Grade III), and four glioblastomas (Grade IV) were sequenced, and all of them displayed the wild-type (WT) sequence. We tried to set up this melting analysis for the genotyping of pediatric astrocytomas by identifying the specific melting temperatures of the TaqMan probes due to the presence of the WT sequences in the isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1 and IDH2) and H3.3 histone A genes (H3F3A). We used an IDH1-TaqMan probe to identify the WT status of IDH1 in two different WT deoxyribonucleic acid (DNA) templates (pilocytic and diffuse astrocytoma) and obtained four melting temperature values ranged from 65.6 to 92.2°C. Furthermore, only four out of 29 reactions displayed amplification of the DNA template. Sanger sequencing was faster and more reliable to detect the gene status in all the sequenced samples. Conclusions: We conclude that conventional Sanger sequencing remains the gold standard for the genotyping of pediatric astrocytomas.

Resumen Introducción: Los astrocitomas son un tipo de cáncer que afecta al sistema nervioso central y representan el tumor sólido más común durante la infancia. En el año 2016, la Organización Mundial de la Salud estableció un sistema de clasificación molecular para reagrupar tumores con identidades genéticas similares y lograr un diagnóstico más preciso, lo que lleva a tomar las decisiones clínicas idóneas al elegir el tratamiento de pacientes con este tipo de tumores. Métodos: Se evaluó un protocolo que involucra el uso de sondas TaqMan en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa asimétrica para la detección de mutaciones en astrocitomas. Se secuenciaron cuatro astrocitomas difusos (Grado II), tres astrocitomas anaplásicos (Grado III) y cuatro glioblastomas (Grado IV). Se intentó establecer las condiciones del análisis para la genotipificación de los astrocitomas pediátricos mediante la identificación de las temperaturas de disociación específicas de las sondas TaqMan producidas por la prescencia de las secuancias WT en los genes isocitrato deshidrogenasa 1 y 2 (IDH1, IDH2) y H3.3 histona A (H3F3A). Resultados: Los astrocitomas mostraron la secuencia wild type (WT) (silvestre) de los genes. Se utilizó una sonda TaqMan IDH1 para identificar el estado de este gen en dos templados WT de DNA (astrocitoma pilocítico y difuso) y se obtuvieron cuatro valores de temperatura de disociación (65.6-92.2 °C). Solo cuatro de las 29 reacciones mostraron amplificación de DNA. La secuenciación de Sanger fue más rápida y confiable para detectar el estado de los genes en todas las muestras. Conclusiones: La secuenciación de Sanger sigue siendo la técnica más práctica para la genotipificación de astrocitomas pediátricos.

Selección de genes de referencia para análisis transcripcionales en el modelo clavel (Dianthus Caryophyllus L.) - Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi / Selection of reference genes for transcriptional analysis in the pathosystem carnation (Dianthus Caryophyllus L.) - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi / Seleção de genes de referência para análise de transcrição no modelo cravo (Dianthus Caryophyllus L.) - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

Resumen En el presente trabajo se seleccionaron y validaron genes de referencia para estudios transcripcionales en el modelo clavel -Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Para ello, se seleccionaron genes asociados a procesos básicos celulares que han sido usados como genes de referencia en otros modelos planta-patógeno y se determinó el efecto de la inoculación del patógeno sobre su expresión. Se realizó un diseño de cebadores para los diferentes genes candidatos con el fin de verificar tanto su presencia en el genoma de claveles cultivados en Colombia, como su transcripción constitutiva en los diferentes tejidos por medio de la técnica de transcripción reversa y posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por sus siglas en ingles). Posteriormente, se evaluaron los niveles transcripcionales de los genes candidatos usando RT-qPCR en tallos y raíces de dos variedades con diferentes niveles de resistencia a la enfermedad, que fueron inoculados con este patógeno. La validación estadística realizada, usando ANOVA y los programas GeNorm y Normfinder, determinó que los genes codificantes para una histona H3 y el ARNr18S no presentan variación en sus niveles de expresión por efecto de la inoculación, permitiendo su uso como genes de referencia en estudios transcripcionales en esta interacción planta-patógeno.

Abstract In this research, reference genes were validated for transcriptional studies in the pathosystem carnation - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Genes associated with basic cellular processes that have been used as reference genes in other plant-pathogen models were selected and the effect of the inoculation with the pathogen on their expression was determined. For this, it was necessary to design primers for each candidate genes to check their presence in the genome of carnations grown in Colombia and their constitutive transcription in different tissues of the plant using reverse transcription subsequent polymerase chain reaction (RT-PCR). The transcriptional levels of the candidate genes were evaluated using RT-qPCR in stems and roots inoculated with this pathogen for two cultivars with different levels of resistance to the disease. According to the statistical validation carried out using ANOVA and the GeNorm and Normfinder programs, the genes coding for a histone H3 and rRNA18S did not show any significant variation in their expression levels due to inoculation, so they can be used as reference genes in transcriptional studies in this plant-pathogen interaction.

Resumo Neste trabalho foram validados genes de referencia para estudos de transcrição no modelo cravo - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Genes associados a processos básicos celulares, anteriormente usados como genes de referencia noutros modelos planta-patógeno, foram selecionados e se determinou o efeito, sobre a sua expressão, que apresentava a inoculação com o patógeno. Foi realizado um desenho de iniciadores para os diferentes genes candidatos para verificou a sua presença no genoma de cravos cultivados na Colômbia, e uma transcrição constitutiva em diferentes tecidos da planta com a técnica de transcrição reversa e posterior reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Em seguida, os níveis de transcrição dos genes candidatos foram avaliados por RT-qPCR em caules e raízes de duas variedades com diferentes níveis de resistência à doença, que tinham sido inoculados com o patógeno. A validação estatística realizada por ANOVA y com os programas GeNorm y Normfinder, permitiram determinar que os genes que codificam para uma histona H3 y para o ARNr 18S, não apresentam variação nos seus níveis de expressão por efeito da inoculação, sugerindo que podem ser usados como genes de referencia em estudos de transcrição nesta interação planta-patógeno.

Optimización del algoritmo diagnóstico de anticuerpos antinucleares / Optimization of the diagnostic algorithm of antinuclear antibodies

Introducción: La prueba de anticuerpos antinucleares es una poderosa herramienta en el diagnóstico de las enfermedades reumáticas. Los anticuerpos antinucleares se determinan en el laboratorio por un algoritmo o secuencia que se inicia con prueba de cribado y sigue con la identificación de las especificidades antinucleares más comunes. Pero, ¿cómo interpretar los resultados discordantes entre los dos niveles de estudio de anticuerpos antinucleares? Objetivo: Determinar las especificidades antinucleares menos frecuentes en pacientes positivos de cribado de ANA y negativos de las especificidades más comunes. Métodos: Estudio prospectivo de 88 pacientes consecutivos remitidos para la detección rutinaria de ANA con resultado positivo de cribado por ensayo inmuno-adsorbente ligado a enzima (ELISA) pero negativo de anticuerpos anti-ADN de doble cadena (dc, IgG) y anti-antígenos nucleares extraíbles comunes (ENAc). Las muestras séricas correspondientes fueron evaluadas por inmunofluorescencia indirecta sobre células de carcinoma epidermoide laríngeo humano (IFI-HEp-2) y por ELISA para la detección individual de ANA específicos. Resultados: La prueba de ANA por IFI/HEp-2 resultó positiva en 56/88 (63,6 por ciento) y las especificidades antinucleares se detectaron en 57/88 (64,8 por ciento) muestras, en el orden decreciente de Anti-Nucs: 16/88 (18,2 por ciento); anti-centrómero (CENP-B): 15/88 (17,0 por ciento); -histona: 15/88 (17 por ciento); -PM/Scl: 13/88 (14,8 por ciento); -ADNsc: 11/88 (12,5 por ciento) y -ENAc individuales: 8/88 (9,1 por ciento). La sensibilidad de la IFI-HEp-2 para las especificidades antinucleares fue de 0,83 (IC95 por ciento: 0,72-0,93). De los pacientes negativos de subserología (26/31), 83,9 por ciento no tenían antecedentes de enfermedad reumática asociada a ANA. Conclusiones: La mayoría de los pacientes con resultados discordantes entre el primer y segundo nivel de ANA fueron positivos de especificidades antinucleares menos comunes, pero de reconocido valor diagnóstico(AU)

Introduction: The antinuclear antibody test is a powerful tool for diagnosing rheumatic diseases. Antinuclear antibodies are determined in the laboratory by an algorithm or sequence that starts with a screening test and continues with the identification of the most common antinuclear specificities. But how to interpret the discordant results between the two levels of study of antinuclear antibodies? Objective: To determine the less frequent antinuclear specificities in positive patients of ANA screening and negative of the most common specificities. Methods: A prospective study was done on 88 consecutive patients referred for the routine ANA screening with a positive result of screening by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) but negative for anti-double-stranded DNA (dc, IgG) and common extractable anti-nuclear antigens (ENAc). The corresponding serum samples were evaluated by indirect immunofluorescence on human laryngeal epidermoid carcinoma cells (IFI-HEp-2) and by ELISA for the individual detection of specific ANA. Results: The ANA test by IFI / HEp-2 was positive in 56/88 (63.6 percent) and the antinuclear specificities were detected in 57/88 (64.8 percent) samples, in decreasing Anti-Nucs order: 16/88 (18.2 percent); anti-centromere (CENP-B): 15/88 (17.0 percent); -histona: 15/88 (17 percent); -PM / Scl: 13/88 (14.8 percent); -ADNsc: 11/88 (12.5 percent) and -ENAc individual: 8/88 (9.1 percent). The sensitivity of IFI-HEp-2 for antinuclear specificities was 0.83 (95 percent CI: 0.72-0.93). No history of rheumatic disease associated with ANA was read in (26/31) 83.9 percent patients with negative subserology. Conclusions: The majority of patients with discordant results between the first and second level of ANA were positive of less common antinuclear specificities, but of recognized diagnostic value(AU)

Regulação epigenética da expressão gênica de Schistosoma mansoni induzida por inibidor de histona deacetilase / Epigenetic regulation of gene expression in Schistosoma mansoni induced by histone deacetilase inhibitor

A esquistossomose é um grave problema de saúde pública, com alta mortalidade e morbidade em países endêmicos, causada pelo verme trematódeo do gênero Schistosoma. O praziquantel é a única droga disponível para tratamento da doença, é usada em larga escala para tratamento de populações de áreas endêmicas, porém não previne a reinfecção e tem efeito somente em vermes adultos. Drogas estudadas em câncer como inibidores de histona deacetilases (iHDACs) modificam o padrão epigenético da célula desencadeando a morte celular, e em Schistosoma mansoni já foi mostrado que a inibição de HDACs além de aumentar a acetilação de histonas alterou o fenótipo de miracídios e provocou morte em esquistossômulos e vermes adultos. O presente estudo investigou o efeito do iHDAC Trichostatin A (TSA) na regulação da transcrição gênica em esquistossômulos, detectando por meio de ensaios de microarray centenas de genes diferencialmente expressos, relacionados a replicação de DNA, metabolismo e complexos modificadores de histonas. A inibição de HDAC em vermes adultos levou a um aumento da acetilação nas marcas de histonas H3K9ac, H3K14ac e H4K5ac relacionadas à indução de transcrição. Com imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR (ChIP-qPCR) detectou-se o aumento de deposição de H3K9ac e H3K14ac na região promotora de genes com expressão aumentada ou diminuída, porém a marca de repressão H3K27me3 não sofreu alteração na região promotora de nenhum gene analisado. Análises adicionais indicaram um conjunto de genes diferencialmente expressos que codificam proteínas histone readers, que fazem parte de complexos modificadores de histonas, como EED capaz de identificar a marca de repressão H3K27me3 e regular a atividade de EZH2, apontando um novo alvo terapêutico. O efeito sinérgico entre iHDAC e um iEZH2 foi testado e detectou-se o aumento da mortalidade de esquistossômulos. A estrutura de SmEZH2 foi modelada por homologia e usada para análises computacionais que sugeriram uma alta afinidade de ligação de SmEZH2 com o iEZH2, abrindo uma perspectiva de desenvolvimento de novas drogas específicas para tratamento da esquistossomose

Schistosomiasis is a serious public health problem, with high mortality and morbidity in endemic countries, caused by trematode worms of the genus Schistosoma. Praziquantel is the only available drug for treatment of the disease; it is used extensively to treat populations in endemic areas, but does not prevent reinfection and is effective only in adult worms. Drugs studied in cancer as histone deacetylase inhibitors (iHDACs) modify the epigenetic status of the cell, triggering cell death, and it has been shown in Schistosoma mansoni that inhibition of HDACs increase histone acetylation, alter the phenotype of miracidia and cause death in schistosomules and adult worms. The present study investigated the effect of iHDAC Trichostatin A (TSA) on the regulation of gene transcription in schistosomules, detecting by means of microarray assays hundreds of differentially expressed genes related to DNA replication, metabolism and histone remodeling complexes. Inhibition of HDAC in adult worms led to an increase in histone acetylation marks H3K9ac, and H3K14ac H4K5ac related to transcriptional induction. With chromatin immunoprecipitation followed PCR (ChIP-qPCR) we detected an increased deposition of H3K9ac and H3K14ac at the promoter region of genes with increased or decreased expression, but the repressive mark H3K27me3 was not changed at all analyzed gene promoter regions. Additional analysis indicated a set of differentially expressed genes that encode histone reader proteins that are part of histone modifier complexes such as EED, which is able to identify the repression mark H3K27me3 and to regulate EZH2 activity, pointing to a new therapeutic target. The synergistic effect between iHDAC and one iEZH2 has been tested and found to cause an increase in schistosomules mortality. The SmEZH2 structure was modeled by homology and used for computational analyses, which suggested a high affinity binding of SmEZH2 with iEZH2, opening the opportunity for development of new specific drugs for treatment of schistosomiasis

Epigenética e doenças humanas / Epigenetics and human diseases

O termo epigenética é definido pela alteração herdável na expressão gênica, sem que haja mudança na sequência primária de DNA, sendo a metilação do DNA e a modificação de histonas, importantes mecanismos envolvidos. A metilação do DNA influencia a organização da cromatina, e leva à repressão de genes e elementos transponíveis. As modificações pós-traducionais que podem ocorrem em proteínas histonas são muitas e podem ocorrer em diferentes aminoácidos e diferentes posições, e resultam em uma multiplicidade de combinações em um verdadeiro “código de histona”, e elas são interpretadas por diferentes fatores celulares. As marcas epigenéticas atuam simultaneamente para regular a transcrição gênica em um processo complexo, e pequenas falhas no estabelecimento ou manutenção desses podem desencadear o desenvolvimento de patologias, como a encontrada em síndromes genéticas e no câncer. Devido ao grande número de doenças, muitas pesquisas têm sido realizadas na busca de drogas capazes de reverter esses defeitos epigenéticos. Atualmente, já foram descritos alguns agentes capazes de interferir na ação de enzimas que regulam os processos, porém, existem ainda muitas dúvidas na aplicatividade desses tratamentos, se fazendo necessário maiores estudos dos mecanismos epigenéticos para, no futuro, serem mapeadas vias de interferências específicas e um melhor controle de efeitos.

The term epigenetics defines heritable changes in gene expression that do not involve DNA sequence changes. DNA methylation and histone modifi cations are two important related mechanisms. DNA methylation alters chromatin structure and has been shown to have a direct effect on the silencing of genes and transposons. There are many post-traductional modifications on histones and an extra complexity comes from many sites and amino acids that may be modifi ed, what results in multiple matches in a real “histone code” decrypted by different cell factors. The epigenetics mechanisms are complex, and minor failing in the establishment and maintenance causes diseases, as genetics syndromes and cancer. Due to several diseases, an increasing amount of research has been realized to find drugs able to suppress these defects. Nowadays, there have already been described some medicines able to interfere in the action of the enzymes which regulate the epigenetic processes, however, there is still doubt in effectiveness of theses treatment. It is necessary additional research about epigenetics mechanism to, in the future, understand specific pathways and control the effects of these drugs.

Corticosteroid therapy for asthma / Corticoterapia no tratamento da asma

Os corticosteroides são os mais efetivos controladores da asma. Eles suprimem a inflamação, principalmente através da inativação de múltiplos genes inflamatórios ativos através da reversão da acetilação da histona via recrutamento da histona desacetilase 2. Suprimindo a inflamação da via aérea, os corticosteroides inalatórios (CSi) reduzem a hiper-responsividade brônquica e controlam os sintomas da asma. Atualmente, os CSi representam a primeira linha de tratamento para todos os pacientes com asma persistente, controlando os sintomas e prevenindo as exacerbações. A associação de β2-agonistas de longa duração aos CSi aumenta o controleda asma e, habitualmente, ambos são administrados em um mesmo dispositivo inalatório, o que aumenta a adesão e o controle da asma com menores doses. A absorção dos CSi dos pulmões para a circulação sistêmica causa efeitos colaterais sistêmicos desprezíveis nas doses que a maioria dos doentes requer. Corticosteroides sistêmicos são usados no tratamentodas exacerbações agudas da asma e como tratamento de manutenção em pacientes com asma grave não controlada coma terapia inalatória máxima. Corticosteroides orais têm numerosos efeitos colaterais metabólicos e endócrinos e devem ser usados na menor dose necessária para controlar a doença

Caracterización molecular de los genes histona H2A y ARNsno-Cl de Trypanosoma rangeli: aplicación en pruebas diagnósticas / Molecular characterization of histone H2A and snoRNA-Cl genes of Trypanosoma rangeli: application in diagnostic tests

La aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar e identificar Trypanosoma rangeli y Trypanosoma rangeli presenta a menudo dificultades de interpretación. Así, algunas pruebas generan la amplificación de bandas similares provenientes de uno de los dos parásitos, fragmentos polimórficos de un mismo parásito, o la prevalencia en la detección de T. cruzi en infecciones mixtas. En este estudio se presentan y analizan los trabajos de investigación básica realizados con el objeto de diseñar y estandarizar pruebas de PCR específicas de cada parásito. Los iniciadores TcH2AF/R se diseñaron sobre la base de la región diferencial observada entre las unidades génicas que contienen los genes h2a en estos tripanosomas. Esta pareja de iniciadores amplifican un fragmento de 234 pb específico para T. cruzi (cepas I y II). Los iniciadores TrF/R2 anillan en las regiones intergénicas del fragmento génico de 801 pb codificante para seis transcritos que forman la agrupación ARNsno-Cl en T. rangeli. Estos iniciadores amplifican un fragmento de 620 pb exclusivo de las cepas KP1(-) y KP1(+) de este parásito. La aplicación de estas PCR en vectores infectados y en pacientes con enfermedad de Chagas muestra que ambas pruebas constituyen herramientas útiles para el diagnóstico y la identificación diferencial de estos tripanosomátidos.

The application of polymerase chain reaction (PCR) to detect Trypanosoma rangeli and Trypanosoma rangeli often presents interpretation challenges. For example, some tests yield the amplification of similar bands from either parasite, polymorphic fragments of the same parasite, or present deviation towards T. cruzi in mixed infections. In this study, the basic researching needed for designing and standardizating specific PCR tests for each parasite species PCR are shown and analyzed. The TcH2AF/R primers were designed on the basis of the differential gene region observed between the histone h2a genic units of these parasites. These primers amplify a specific 234 bp fragment in T. cruzi (T. cruzi I and II strains). The TrF/R2 primers anneal to the intergenic regions of an 801 bp gene fragment encoding for six transcripts that conform the snoRNA-Cl cluster in T. rangeli. These primers amplify a fragment of 620 bp exclusively in KP1(-) and KP1(+) strains of the parasite. The application of these PCR tests in infected vectors and in chagasic patients show that both tests constitute useful tools for the diagnosis and differential identification of these Trypanosomatids. Key words: histone, RNA small nucleolar (snoRNA), polymerase chain reaction (PCR), Trypanosoma.

Diseño y estandarización de una prueba de PCR para la detección específica de Trypanosoma cruzi / PCR design and standardization for Trypanosoma cruzi specific detection

Objetivo: Tripanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, presenta dos tipos de unidades H2A:1,2 y 0,76 Kb. Dada la ausencia de la unidad de 1,2 KB en T. rangeli, en este trabajo se desarrolló una prueba de PCR para la detección de T. cruzi, usando como blanco este gen. Materiales y métodos: los oligonucleótidos TcH2AF y TcH2AR fueron diseñados usando el programa Oligo TM versión 4.0 for Macintosh. La reacción de PCR (Tris-HCI 10 mM pH 9, KCl 50 mM, triton x-100 0,1 por ciento dNTPs 200 mM, cebadores 20 pmoles, MgCl2 1,5 mM, Taq DNA polimerasa 1,25 U y ADN 125 ng) fue sometida al siguiente programa en un termociclador PTC-100 MJ-Research: denaturación 95°C por 5 min, 15 ciclos con denaturación a 95°C por 30 s, anillaje y extensión a 72°C por 1 min y 20 ciclos con anillaje a 65°C durante 30 s y extensión a 72°C por 30 s. los productos amplificados fueron visualizados en geles de agarosa al 1,5 por ciento, teñidos con bromuro de etidio. Resultados: TcH2AF/R amplifican una banda de 230 pb en cepas pertenecientes a los Zimodemas I, II y III de T.cruzi, con una sensibilidad de 1fg aun en la presencia de ADN heterólogo; mientras que no amplifican el ADN de cepas de T. rangeli tanto KP1(+) como KP(-). Conclusiones: esta PCR constituye una herramienta potencial para la detección de T. cruzi en muestras biológicas de vector, humano y/o ratón