Modulação da diferenciação neural de células troco embrionárias por transientes de cálcio intracelulares: papéis dos receptores purinérgicos e de canais de cálcio voltagem-dependentes / Modulation of neural embryonic stem cell differentiation by intracellular Ca2+ oscillations. Roles of purinergic receptors and voltage gated Ca2+ channels

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal

Purinergic receptors and voltage gated Ca2+ channels have been attributed with developmental functions including gastrulation and neural differentiation. Upon activation, nucleotide-activated P2 purinergic receptor and voltage-gated Ca2+ channel subtypes trigger intracellular calcium transients controlling cellular processes. Here, we studied the participation of voltage-gated calcium channels and P2 receptor activity in spontaneous calcium transients and consequent regulation expression of transcription factors related to retinoic acid-induced neurogenesis of mouse neural stem and embryonic stem cells (ESC). In embryonic pluripotent stem cells, proliferation is accelerated by P2X7 receptor activation, while receptor expression / activity needs to be down-regulated for the progress of neuroblast differentiation. Moreover, along neural differentiation time lapse imaging with means of a cytosolic calcium-sensitive fluorescent probe provided different patterns of spontaneous calcium transients (waves and spikes) showing that both, frequency and amplitude increased along differentiation. Cells treated with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor Xestospongin C showed spikes but not waves, indicating that waves exclusively depended on calcium release from endoplasmic reticulum by IP3R activation. Cells treated with the P2X7 receptor subtype agonist Bz-ATP and the P2Y2 and P2Y4 receptor 2-S-UTP increased frequency and amplitudes of calcium transients, mainly spikes, in embryonic telencephalon neural stem cells (NSC) and NSC pre-differentiated from ESC. Data obtained by luminescence time lapse imaging of stable transfected cells with Mash1 or Ngn2 promoter-protein fusion to luciferase reporter construct revealed increased Mash1 expression due to activation of P2Y2/P2Y4 receptor subtypes, while increased expression of Ngn2 was observed following P2X7 receptor activation. In addition, cells imaged in presence of the extracellular calcium chelator EGTA or following endoplasmic reticulum calcium store depletion by thapsigargin showed a decrease in Mash1 and Ngn2 expression, indicating that both are regulated by calcium signaling. Investigation of the roles of voltage gated Ca2+ channels in neural differentiation showed that Ca2+ influx in NSC pre-differentiated from ESC is due to membrane depolarization and L-type voltage gated Ca2+ channel activation, thereby controlling cell fate decision, by stabilizing the expression of MASH1 and inducing differentiation, by phosphorylation of the transcription factor CREB. Altogether these data suggest that P2X7, P2Y2, P2Y4 receptors and L-type voltage gated Ca2+ channels can modulate spontaneous calcium oscillations during neural differentiation and consequently change the Mash1 and Ngn2 expression patterns, thus favoring the cell fate decision to the neuronal phenotype

Expressão citofotométrica da Caspase-3 no carcinoma papilífero da tireóide e no bócio colóide / Citophotometric expression of Caspase-3 in papillary thyroid carcinoma in nodular goiter colloid

OBJETIVO: Descrever a expressão citofotométrica quantitativa do marcador caspase-3 no bócio colóide e no carcinoma papilífero da tireóide e comparar a imunoexpessão entre as doenças. MÉTODOS: Realizou-se estudo imunoistoquímico da proteína caspase-3 em 17 blocos de parafina de carcinoma papilífero da tiróide e 20 de bócio colóide, através do sistema SAMBA 4000 - (Sistema de análise microscópica de busca automática), objetivando-se analisar duas variáveis: índice de marcagem e densidade óptica. RESULTADOS: Houve diferença significativa quanto ao índice de marcagem da caspase-3, entre o bócio colóide e o carcinoma papilífero, sendo maior no carcinoma, e não foi encontrada diferença significativa quanto à densidade óptica. Para o bócio colóide, o coeficiente de correlação estimado entre o índice de marcagem e a densidade óptica foi igual a 0,72, indicando assim, a rejeição da hipótese nula (p <0,001), afirmando-se que existe associação positiva e significativa entre o índice de marcagem e a densidade óptica da caspase-3. Para o carcinoma papilífero da tiróide, o coeficiente de correlação estimado entre o índice de marcagem e a densidade óptica 3 foi de 0,34. O resultado do teste estatístico indicou que não se pode afirmar que existe associação entre esses parâmetros. CONCLUSÃO: Para o bócio colóide existe associação positiva e significativa entre as duas variáveis, índice de marcagem e a densidade óptica da caspase-3, enquanto que para o carcinoma papilífero não existe essa associação. O estudo comparativo entre a análise quantitativa da caspase-3, demonstrou que a apoptose é mais evidente no carcinoma papilífero do que no bócio colóide.

OBJECTIVE: To describe quantitative cytophotometric expression of the marker caspase-3 in colloid goiter and in papillary carcinoma of the thyroid, comparing the immunoexpression between them. METHODS: An immunohistochemistry study has been made on the protein caspase-3 in 17 of paraffin blocks of papillary carcinoma of the thyroid and 20 cases of colloid goiter, using SAMBA 4000 ® (System of Microscopic Analysis of Automatic Search), aiming analysis of the two variables: marker index and optical density. RESULTS: Statistic analysis indicated a significant difference for marker index between colloid goiter and papillary carcinoma, being this difference larger in the carcinoma. It hasn't been found significant difference in optical density. For colloid goiter, the estimated correlation coefficient between the marker index and optical density was 0,72, indicating the rejection of the null hypothesis (p <0,001), affirming that positive and significant association exists between them. For the papillary carcinoma of the thyroid, the same correlation was 0,34 and so, it is not possible to affirm that there's an association between them. CONCLUSION: For colloid goiter there is a positive and significant association between the two variables - marker index and optical density -, while for the papillary carcinoma, this is not proved. The quantitative analysis for caspase-3 demonstrates that apoptosis is larger in the papillary carcinoma of the thyroid than in colloid goiter.

Estudo citofotométrico da expressão dos marcadores tumorais Ki-67 e CD34 no adenocarcinoma de próstata / Cytophotometric expression of tumor antigen markers Ki-67 and CD-34 in prostate adenocarcinoma

OBJETIVO: Quantificar a porcentagem da imunomarcação no índice de marcagem e densidade óptica do Ki-67 e CD34 no adenocarcinoma de próstata e compará-las entre si. MÉTODOS: Foram estudados, através de imunoistoquímica, o Ki-67 e o CD34 em 34 casos de adenocarcinoma de próstata provenientes de prostatectomia radical no período de 2000 a 2005 realizado no Hospital Regional do Gama em Brasília. Estes marcadores foram quantificados através do software SAMBA 4000 ® Sistema de Análise Microscópica de Busca Automática e do software IMMUNO® para análise das variáveis índice de marcagem e densidade óptica. Para avaliação da associação entre as expressões do marcador, foi estimado o coeficiente de correlação de Spearman. Para a comparação do tipo de lesão, foi usado o teste t de Student em amostras pareadas e não paramétrico de Wilcoxon. RESULTADOS: Dos 34 blocos que foram para leitura dos marcadores tumorais, 15 marcaram expressão com Ki-67, 34 com CD34 e 14 com ambos os marcadores. O índice de marcagem do CD34 teve valor mediano de 72,72 por cento, valor mínimo 5,14 por cento e valor máximo 88,81 por cento. O índice de marcagem do Ki-67 teve mediana de 73,78 por cento, mínimo de 16,87 por cento e máximo de 87,47 por cento. A densidade óptica do CD34 teve mediana de 48,33, mínimo de 35,65 e máximo de 85,86. Na densidade óptica do Ki-67 o valor da mediana foi 40,03 sendo a mínima de 21,53 e a máxima de 52,43. CONCLUSÃO: A expressão citofotométrica do Ki-67 teve índice médio de marcação de 64,04 por cento e o CD34 de 61,64 por cento. A expressão citofotométrica da densidade óptica média do Ki-67 foi de 39,49 e no CD34 de 53,69. Há diferença significativa entre a imunomarcação do Ki-67 e CD34 em relação à densidade óptica (p=0,025), não havendo diferença significativa no índice de marcagem (p=0,470).

OBJECTIVE: To quantify the percentage of immunostaining through the labeling index as well as the optical density of Ki-67 and CD34 in prostate adenocarcinoma and compare the results between markers. METHODS: Markers Ki-67 and CD34 were studied using immunohistochemistry in 34 cases of prostate adenocarcinoma from radical prostatectomies performed at the Hospital Regional do Gama in Brasilia, Brazil from 2000 through 2005. Those markers were quantified using the SAMBA 4000® software - Automated Scanning Microscopic Analysis System - and the IMMUNO® software in the analysis of the variables labeling index and optical density. Spearman's correlation coefficient was estimated in order to evaluate the association between the expression levels of the markers. For the comparison of lesion types, Student's paired t-test and the nonparametric Wilcoxon test were used. RESULTS: Of the 34 blocks referred for the study of the tumor markers, 15 were positive for Ki-67, 34 showed CD34 expression, and 14 were positive for both markers. The median value for the labeling index of CD34 was 72.72 percent; the minimum was 5.14 percent and the maximum, 88.81 percent. The median for the Ki-67 labeling index was 73.78 percent, while the minimum was 16.87 percent, and the maximum, 87.47 percent. The median value for the optical density of CD34 was 48.33, the minimum was 35.65 and the maximum, 85.86. For the optical density of Ki-67, the median was 40.03, while the minimum and maximum values were 21.53 and 52.43, respectively. CONCLUSION: The cytophotometric expression of Ki-67 had a mean labeling index of 64.04 percent, and the mean CD34 labeling index was 61.64 percent. The cytophotometric expression of the mean optical density of Ki-67 was 39.49, while for CD34 it was 53.69. There was a significant difference between Ki-67 and CD34 immunostaining with respect to optical density (P=0.025); no significant difference occurred regarding labeling index (P=0.470).

Expressão citofotométrica quantitativa da CASPASE-3 e do CD-34 no carcinoma ductal infiltrante de mama / Cytophotometric expressions of CASPASE-3 and CD-34 in breast cancer

OBJETIVO: Descrever, correlacionar e comparar a expressão dos marcadores tumorais CD-34 (angiogênese) e caspase-3 (apoptose) em carcinoma ductal invasor de mama. MÉTODOS: Foram utilizados 22 casos de adenocarcinoma infiltrante de mama provenientes de blocos de parafina e, após preparo específico para imunoistoquímica, 15 apresentaram leitura satisfatória e foram avaliados pelo sistema de fotocitometria de imagem SAMBA 4000® e software IMMUNO®. Os parâmetros analisados foram o índice de marcagem e densidade óptica. RESULTADOS: Para o CD-34 não houve normalidade dos dados na análise do índice de marcagem, com obtenção de P=0,019, havendo normalidade para a análise da densidade óptica, com P=0,199. Para a caspase-3 houve normalidade de dados para o índice marcagem com P=0,306 e para a densidade óptica com P=0,114; não houve diferença estatística significativa entre eles em relação à média do índice de marcagem (P=0,872) e da densidade óptica (P=0,816), quando analisados os parâmetros que definem a expressão dos marcadores; existiu tendência à associação entre a densidade óptica e o índice de marcagem do marcador tumoral caspase-3, com P=0,025. Não foi observada tendência à associação quando comparados densidade óptica e índice de marcagem do marcador tumoral CD-34; índice de marcagem do marcador tumoral caspase-3 e índice de marcagem do marcador tumoral CD-34; e densidade óptica da caspase-3 com a do CD-34. CONCLUSÃO: Dos 22 casos incluídos foi possível verificar a expressão do marcador CD-34 em 18 lâminas e da caspase-3 em 22 lâminas; Para o CD-34 não houve normalidade dos dados na análise do índice de marcagem, havendo sim normalidade para a análise da densidade óptica. Para a caspase-3 houve normalidade de dados tanto para o índice de marcagem como para a densidade óptica. Existe tendência à associação entre a densidade óptica e o índice de marcagem da caspase-3. Não foi observada tendência quando comparados densidade óptica e índice...

OBJECTIVE: Describe, correlate and compare the expression of the tumor markers CD 34 (angiogenesis) and caspase-3 (apoptosis) in invasive breast adenocarcinoma, through image cytometry with the system SAMBA4000®. METHODS: Twenty-two cases of invasive breast adenocarcinoma from paraffin-embedded archival tissue, and after specific prepare, fifteen cases presented a satisfactory lecture with SAMBA4000® and could, finally, be evaluated by the software IMMUNO® (n = 15). The parameters analysed were the label index - in percentage, indicating the marked surface - and the optical density, in pixels - indicator of the marker intensity. The results were tabulated and expressed in averages, mediums, minimum and maximum values. The statistic analysis was realized by the Shapiro-Wilkins, Student test, Pearson's and Spearman's correlation, with statistic significance for values from p < 0,05. RESULTS: There was no data normality for the label index CD34 (p= 0,019), there was normality in the analysis of the optical density of both markers and label index of the marker Caspase-3. There was no difference relating to the average of the index marker and the optical density when they were compared. CONCLUSIONS: There was a tendency to correlate the label index and the optical density of the tumor marker caspase-3, the same did not occur with the tumor marker CD 34. Other analysis did not show any correlation between the two studied markers. Other studies involving theses two cell processes are needed to extend the knowledge of the cancer biomolecular mechanic and to permit new diagnostic and therapeutic strategies.

Expressão citofotométrica do fator de proliferação celular ki-67 no bócio colóide e no carcinoma papilífero da tireóide / Citophotometric expression of the factor of cellular proliferation ki-67 in the goiter colloid and in the papillary carcinoma of the thyroid

Objetivo: Comparar a expressão citofotométrica quantitativa do fator de proliferação celular Ki-67 no bócio colóide com o do carcinoma papilífero da tireóide. Métodos: Foram estudadas a expressão da proteína Ki-67, em 12 casos de bócio colóide da tireóide e 20 casos de carcinoma papilífero da tireóide. Os núcleos celulares imunomarcados foram quantificados através do software SAMBA 4000 ® e do software IMMUNO®, analisando o índice de marcagem e densidade óptica. Foi estimado o coeficiente de correlação de Spearmane e o teste não- paramétrico de Mann-Whitney. Resultados: Foi rejeitada a hipótese nulapara o índice de marcagem. confirmando que existe diferença significativa entre o bócio colóide e o carcinoma papilífero da tireóide, quanto ao índice de marcagem do Ki-67, que são maiores nos carcinomas papilíferos da tireóide. Não foi encontrada diferença quanto à densidade óptica. Quanto ao bócio colóide, o coeficiente de correlação estimado entre o índice de marcagem e adensidade óptica do Ki-67 foi igual a 0,78. No bócio colóide, houve associação positiva e significativa entre o índice de marcagem e a densidade ótica do Ki-67. Para o carcinoma papilífero da tireóide o coeficiente de correlação estimado entre o índice de marcagem e a densidade ótica do Ki-67 foi igual a 0,18. Não houve no carcinoma papilífero de tireóide, associação entre o índice de marcageme a densidade ótica do Ki-67. Conclusão: A expressão citofotométrica do Ki67 no bócio colóide teve índice médio de marcação de 13,92% e densidade óptica média de 36,43; a expressão citofotométrica do Ki-67 no carcinoma papilífero teve índice médio de marcação de 38,29% e densidade óptica média de 48,07%; há maior proliferação celular no carcinoma papilífero em comparação com o bócio colóide na expressão do Ki-67.

Objective: To compare the cytophotometric quantitative expression of Ki-67 cellular proliferation factor in the colloid goiter with papillary carcinoma of the thyroid. Methods: The protein Ki-67 was studied with immunohistochemistry in 20 cases of papillary carcinoma of the thyroid and 12 cases of colloid goiter. The immunomarked cell nuclei were quantified through the software SAMBA4000 ® and analyzed by software IMMUNO ®, considering variables index marker and optical density. The coefficient of the Spearman rank correlation and the non-parametric test of Mann-Whitney wre estimated. Results: There is significant difference between the goiter colloid and the papillary carcinoma of the thyroid in Ki-67 measurements, being bigger in papillary carcinomas. No difference wasfound in optical density. The correlation coefficient between the index marker and the optic density was 0,78. In colloid goiter, there was positive and significant association between the index marker and the optic density. For the papillary carcinoma of the thyroid thecorrelation between index marker and optic density was 0,18 (p = 0,572). There was no association between the index marker and the optic density in the carcinoma papillary of the thyroid. Conclusion: The cytophotometric expression of the Ki-67 showed higher cellular proliferation in the papillary carcinoma of the thyroid in comparison with in the colloid goiter.

Expressão citofotométrica dos marcadores tumorais CD-34 e fator VIII no câncer de cólon / Cytophotometric expression of the tumor markers CD-34 and factor VIII in colorectal cancer

OBJETIVOS: Verificar a posssibilidade de quantificar a expressão dos marcadores tumorais CD-34 e Fator VIII no câncer de cólon; verificar se existe superioridade entre um marcador e outro para estudo da angiogênese; verificar se há correlação na análise do índice de marcagem e a densidade óptica média nos marcadores utilizados. MÉTODOS: Dezessete casos de adenocarcinoma colorretal recuperados de blocos de parafina e confirmados pela hematoxilina-eosina, foram submetidos à coloração imunoistoquímica pelo método da estreptoavidina-biotina-peroxidase e utilizados os marcadores tumorais CD-34 e Fator VIII. Após este processo as lâminas foram submetidas à leitura no sistema Samba 4000® e avaliadas pelo software Immuno®. Os parâmetros estudados foram: índice de marcagem e densidade óptica, expressos por médias, medianas, valores mínimos, valores máximos e desvios-padrão, analisados estatisticamente. RESULTADOS: Para o marcador CD-34 não houve normalidade dos dados em relação ao índice de marcagem e houve para a densidade óptica. Para o Fator VIII, houve normalidade de dados em relação ao índice de marcagem e para a densidade óptica. CONCLUSÃO: Foi possível quantificar a expressão dos marcadores tumorais CD-34 e Fator VIII através do índice de marcagem e da densidade óptica média; não houve diferença entre os marcadores em relação à média do índice de marcagem e da densidade óptica, não sendo possível definir superioridade entre um e outro; não foi observada tendência à correlação quando comparados densidade óptica e índice de marcagem do Fator VIII e do CD-34 isoladamente estudados; não houve correlação entre o índice de marcagem do Fator VIII quando comparado com o CD-34, bem como a densidade óptica do Fator VIII com o CD-34.

OBJECTIVES: In colorectal cancer, to describe the cytophotometric expression of the CD-34 and Factor VIII; to evaluate the degree of correlation between them; and to compare the CD-34 and Factor VIII expressions in relationship to label index and optical density. METHODS: Seventeen cases of colorectal adenocarcinoma recovered from paraffin-embedded archival tissue and confirmed by hematoxilin-eosin staining, were submitted to streptavidin-biotin-peroxidase immunohistochemical method. In this process was used the tumor markers CD-34 and Factor VIII. The obtained slides were analysed using the SAMBA 4000® system with Immuno® software. The results were evaluated into two parameters: label index and optical density, and expressed by averages, medians, minimum values, maximum values, and standard deviation values. The normality condition of the quantitative variables was investigated by using the Shapiro-Wilks test. In order to evaluate the degree of association between the expressions of the markers, Pearson's Correlation Coefficient or Spearman's Correlation Coefficient were applied. To evaluate the comparison degree of the markers expression, Student's t test or Wilcoxon's no parametric test were used. RESULTS: For the CD-34 there was no data normality for the label index and there was normality in the optical density. For the Factor VIII, there was data normality for the label index and for the optical density. CONCLUSION: When the expressions of CD-34 and Factor VIII markers were correlated, there was no difference between them in relationship to the average label index and average optical density. When the expressions of the CD-34 and Factor VIII were compared, there was no correlation between the two variables.

Apoptosis in oral diagnostics: an overview

Apoptosis describes the molecular and morphological processes leading to controlled cellular self destruction. In recent years, it has been investigated for its biological significance in numerous physiological processes including embryogenesis, differentiation, proliferation /homeostasis and in the regulation of immune system. Its dysfunction and deregulation seems responsible for variety of pathological conditions e.g immune deficiency, autoimmune diseases, neuro-degenerative diseases and cancer. This communication updates molecular understanding of this natural phenomenon and its application in oral diagnostics. The present concept of signaling pathways for initiation of apoptotic characteristic changes is illustrated and the role of certain apoptotic genes identified so far is discussed. Abnormality of apoptosis and apoptotic regulatory genes during oral carcinogenesis. though conflictory, is presented. Further, clinical potential for monitoring reactions to chemo-radiotherapy is evaluated from human and animal studies and their usage as physiological markers for oral preneoplasia and squamous cell carcinoma is analyzed. On the basis of oral cytology the application of new physical and molecular methodological techniques is outlined e.g cytophotometry, DNA cytometry in relation to molecular studies and their diagnostic and prognostic implications. Understanding of molecular mechanisms provides development of newer therapeutic approaches in disease management and in future biomedical research. This overview updates molecular understanding of this natural phenomenon as its applications seem to have potential for managing common diseases in future

Establishment of a method for determining the sphingosine kinase activity and its initial application / 中国应用生理学杂志

<p><b>AIM</b>To establish the methods for determining the activity of sphingosine kinase(SPK) and the content of sphingosine 1-phosphate (S1P) in biological samples.</p><p><b>METHODS</b>The ECV304 cells were transfected with pcDNA3 vector encoding Flag-labeled SPK gene. The expression of SPK was measured by Western blot assay and the activity of SPK was determined by enzymatic reaction, isotope incorporation and thin-layer chromatography methods. The S1P in biological samples was extracted, digested by alkaline phosphatase and then catalyzed by SPK. The S1P contents were determined according to the amounts of products.</p><p><b>RESULTS</b>SPK gene transfection could enhance the expression and activity of SPK in cells markedly, and the cellular S1P was also increased obviously. HGF stimulation could increase the activity of SPK and cellular S1P in ECV304 cells.</p><p><b>CONCLUSION</b>Methods for determining the activity of SPK and the content of SPK in biological samples were established.</p>

Study on relationship between changes of geometry parameters in human spleen nuclei and the postmortem interval / 法医学杂志

OBJECTIVE@#Using computer image-analyze technique (CIAT) to study changes of geometry parameters in human spleen nuclei and seek a new experimental method to deduce the estimation the postmortem interval (PMI).@*METHODS@#31 cadavers that known accurate PMI, sampled and smeared respectively every hour within the first 36 hours after death, fixed with cold Carony fixation, stained by Feulgen-van's method, and measured 5 geometry parameters using the image-analyze instrument including Area (A), Mean-Dia (MD), Average Diameter (AD), perimeter (P), Index of density (ID).@*RESULTS@#A, MD, AD and P in the human spleen nuclei have no correlation with the PMI. But ID rose regularly with the prolongation of PMI in 36 hours. There was a definite correlation between ID and the PMI, r=0.983, linear regression equation with PMI (hours) as the dependent variable was calculated for ID.@*CONCLUSION@#Geometry parameter ID was proved to be preferable indexes for estimation of PMI in 36 hours.

Veneno de Latrodectus mactans de Chile (Araneae, Theridiidae): su efecto sobre músculo liso / Venom of Latrodectus mactans from Chile (Araneae, Theridiidae): effect on smooth muscle

The venoms of Latrodectus sp. have been reported to induce contraction probably mediated by adrenergic and cholinergic transmitters. We have demonstrated that the venom of Chilean Latrodectus mactans contains neurotoxins that induce a contraction partially independent of transmitters release. Transmembrane mobility of Na+ and Ca2+ ions and more specifically, the increase of cytoplasmic calcium concentration are responsible for tonic contraction in smooth muscle. Calcium may enter the cell by several ways, such as the voltage-dependent Ca2+ L-type channels and the Na+/Ca2+ exchanger. This study aimed to examine the participation of this exchanger in the tonic contraction of smooth muscle in vas deferent of rat induced by the venom of the Chilean spider L. mactans. Blockers of Na+ channels (amiloride) and Ca2+ L-type channels (nifedipine), and a stimulator of the exchanger (modified Tyrode, Na+ 80 mM) were used. Simultaneously, variations of the cytoplasmic concentration of Ca2+ were registered by microfluorimetry (Fura-2 indicator) in the presence of nifedipine. In presence of amiloride, dose-dependent inhibition of venom-induced contraction was observed, suggesting the participation of voltage-dependent Ca2+ L-type channels. The contraction was only partially inhibited by nifedipine and the Ca2+ cytoplasmic concentration increased, as assessed by the microfluorimetric registration. Finally, the venom-induced contraction increased in the presence of modified Tyrode, probably due to the action of the Na+/Ca2+ exchanger. Taken together, our results support the idea that the Na+/Ca2+ exchanger is active and may be, at least in part, responsible for the contraction induced by the venom of Chilean L. mactans.

Citofotometria do ADN de células do colo do útero infectadas e näo infectadas pelo papiloma vírus humano / Cytophotometric of the cervix cells DNA infected and non infected by the papiloma human virus

Este estudo tem como objetivo determinar características citofotométricas dos núcleos das células do colo uterino infectadas ou näo pelo HPV, considerando o número de cópias virais. Incluiu-se 69 pacientes entre 16 e 48 anos, que realizavam avaliaçäo ginecológica de rotina, citologia oncótica e colcoscopia. As suspeitas de lesäo por HPV à colcoscopia, foram consideradas grupo de estudo e submetidas à biópsia (n=40); as que näo apresentaram lesäo foram consideradas grupo controle (CT, n=29). Confirmou-se a infecçäo ou näo de HPV pela captura híbrida, quantificando ainda em baixa cópias virais (BC ,100) e altas cópias(AC.100). Realizou-se citofotometria pela coloraçäo de FEULGEN e uso do sistema SAMBA 4000. Os resultados demonstram: área nuclear menor em AC que CT e BC (p<0,05), com alta sensibilidade na diferenciaçäo de CT x AC e BC x AC; densidade óptica integrada maior em BC que CT e AC (p<0,05); BC e AC apresentaram maior índice de pequenos agrupamentos de cromatina e de contraste que CT; BC e AC apresentaram menor índice de grandes agrupamentos de cromatina e de energia que CT; a taxa de ploidia foi semelante entre os tres; BC apresentou mais núcleos nas fases S, G2 e M que CT. Concluiu-se que a citofotometria do ADN do núcleo das células do colo uterino foi capaz de diferenciar entre CT, BC e AC, em diferentes níveis de sensitividade e especificidade, segundo os diversos parâmetros analisados, dos núcleos infectados pelo HPV em comparaçäo aos näo infectados

Cáncer de mama: contenido de ADN como factor pronóstico / Breast cancer: DNA content as prognostic factor

El estudio y caracterización biológica en el cáncer de la mama permitir adoptar terapéuticas acordes con el grado de agresividad biológica. La utilidad de la determinación del contenido de ADN en el cáncer de mama ha demostrado resultados contradictorios. Se determinó el contenido de ADN de 100 carcinomas de la mama mediante citofotometría y su relación con: tipo histológico, atipia, grado tumoral, mitosis y presencia de metástasis. El promedio de edad del grupo fue de 57,1 años (26-86 años). En 77 casos (77 por ciento) se realizó mastectomía. El tamaño promedio de los tumores fue 3,5 cm (DSñ 2,0 cm). El carcinoma ductal infiltrante fue el más frecuente en 95 casos (95 por ciento). En 37 de los 84 casos (44 por ciento) con linfoadenectomía axilar se encontró metástasis. En el 60 por ciento de los casos se observó contenido aneuploide de ADN. El índice promedio de ADN en los tumores aneuploides fue de 1,2 (DSñ 0,29). No se observaron diferencias entre los tumores diploides y aneploides respecto de la edad, raza, procedimiento quirúrgico ni tamaño tumoral. La frecuencia de aneuploidia fue mayor en relación al grado de atipia (grado I 28,6 por ciento, grado III 68 por ciento), mitosis (I 55 por ciento, III 60 por ciento) y grado tumoral (grado I 65 por ciento, grado III 70 por ciento), sin embargo, estas diferencias no fueron significativas. En los tumores diploides de ADN se observó un 29 por ciento de metástasis linfática, en cambio, en los tumores aneuploides un 55 por ciento (p= 0,02). Nuestro estudio demuestra la relación existente entre contenido de ADN y la presencia de metástasis linfáticas en el cáncer de mama y su potencial uso como factor pronóstico

Estudo citofotométrico comparativo do ADN entre o carcinoma gástrico da pequena e grande curvaturas do estômago / Citophotometric study comparative between DNA and the gastric carcinoma from the small and great stomach curvatures

O câncer gástrico é um tumor cuja a sua agressividade varia de acordo com a sua localização e tipo histológico. A sua incidência no Brasil, assim como em outras partes do mundo está em declínio e ocupa o quarto lugar na incidência das doenças malignas. Devido a sua alta incidência e em alguns países o aumento da mortalidade, vários estudos estão sendo realizados como o objetivo de melhor conhecer esta patologia e consequentemente obter melhores resultados com os tratamentos atuais e novas descobertas. O presente estudo, fazendo parte de linha de pesquisa visa estudar os núcleos dos carcinomas gástricos da pequena e grande curvatura do estômago. Utilizaram-se 28 casos de tumores malignos do estômago, sendo 12 da grande curvatura e 16 da pequena, todos de origem de material de arquivo emblocados em parafina. Após a desparafinização e destruição das estruturas celulares com exceção do núcleo, procedeu-se à realização do esfregaço citológico dos núcleos e à coloração pela técnica de FEULGEN. Realizou-se a citofotometria do ADN mediante o equipamento SAMBA 4000. Os resultados foram comparados entre a pequena e grande curvaturas do estômago pelo estudo de 15 parâmetros matemáticos. No parâmetro morfométrico, área nuclear (parâmetro 1) encontrou-se como média da área nuclear para os núcleos dos tumores da pequena curvatura de 9.343 pontos de imagem e de 8.850 pontos de imagem para os núcleos dos tumores da grande curvatura. Os parâmetros ligados a densitometria do núcleo celular, densidade óptica integrada (parâmetro 2), encontrou-se como média 2.545 unidades arbitrárias (u.a.) para os núcleos da pequena curvatura e de 2.242 u.a. para os núcleos da grande curvatura; coeficiente de assimetria ou índice de "Skewness(parâmetro 4) encontrou-se como média 3,12 u.a. para os tumores da pequena curvatura e de 1,85 u.a. para os tumores da grande curvatura do estômago. Nos parâmetros ligados à textura da cromatina nuclear, média local das matrizes de coocorrência (parâmetro 12), encontrou-se como média 153 u.a. e 160 u.a. para a pequena e grande curvatura respectivamente; segundo momento ou energia das matrizes de coocorrêncisas (parâmetro 13) apresentou média de 11,20 u.a para a pequena curvatura e 10,04 u.a. para a grande curvatura; contraste das matrizes de coocorrência (parâmetro 15) observou-se média de 566 u.a. e 485 u.a. para a pequena e grande curvaturas respectivamente

Determinación del contenido de ADN en tumores de glándulas salivales / Determination of DNA content of salivary gland tumors

Background: DNA content determination is a useful tool in the characterization of different malignant tumors. Aim: to measure DNA content in cells of salivary gland tumors as adjunct to histological diagnosis, correlatting morphologic and biological features of these tumors. Material and methods: from the archives of the pathology service of a general hospital, 21 salivary gland tumors, 15 pleomorphic adenomas, 3 mucoepidermoid carcinomas and 3 cystic adenoid carcinomas were seleced. DNA content was determined in the histological samples using a flow cytometric DNA analysis. Results: all pleomorphic adenomas had a normal or diploid DNA content. Fifty percent of malignant tumors had an aneuploid DNA content (1 mucoepidermoid carcinoma and 2 cystic adenoid carcinomas). Conclusions: DNA determination may help in the histological diagnosis of salivary gland tumors. The presence of aneuploidy suggests malignity

Determinación de la ploidia del ADN por citofotometría en líquidos pleural y abdominal y su correlación con diagnóstico citológico convencional (Estudio de 40 casos) / (DNA ploidym image cytometry and cytology of pleural and abdominal fluids)

Se realiza un análisis prospectivo de 40 líquidos corporales, 22 abdominales y 18 pleurales, recibidos en un lapso de 5 meses. Se estableció una correlación entre el exámen citológico de rutina y la ploidia del ADN, determinada por citofotometría. De los 25 casos clasificados citológicamente como benignos, 21 fueron diploides y 4 aneuploides; sólo uno de estos últimos al revaluarse la citología fue considerado como no neoplásico, los otros 3 fueron falsos negativos. De los 15 casos considerados citológicamente como malignos, 3 fueron diploides y sólo uno de estos fue un falso positivo por citología. Los otros 2 fueron: 1 linfoma y 1 mesotelioma, mismos que con gran frecuencia pueden ser diploides. La sensibilidad y la especificidad por ambos métodos fueron de 77 y 95 por ciento y de 94 y 95 por ciento respectivamente. De lo anterior concluimos que la Cl nos puede ayudar a detectar aneuploidia en algunos casos diagnosticados en citología como falsos negativos (3 de nuestros casos); pero en algunos casos las células malignas pueden ser diploides (20 por ciento de nuestros casos) y entonces la Cl no nos permitiría detectarlos como malignos y es aquí donde la citología de rutina es indispensable

Citofotometria de imagem na analise do DNA de testiculos distroficos / DNA image cytophotometry in maldescended testes

Durante a infancia, a distopia testicular e uma situacao nao rara, onde o(s) testiculos(s) se encontra(m) fora da bolsa escrotal. Este fato parece contribuir com infertilidade durante a vida adulta, bem como com risco aumentado de desenvolvimento de neoplasias. E grande o interesse de diversos pesquisadores no encontro de minimas alteracoes citomorfologicas ou funcionais que possam servir de causa ou consequencia de tal entidade...

DNA-feulgen cytophotometry in hyperplasia and adenocarcinoma of the endometrium

The present study was carried out on 35 endometrial hyperplasia, 30 endometrial carcinoma and 5 normal proliferative phase endometrium. Cases were stained with hematoxylin and eosin and Feulgen stain for cytophotometry. The majority of cells in the normal and the hyperplastic groups, including atypical hyperplasia were within the diploid range, whereas more than 65% of the cells in the carcinoma group, were aneuploid with increase in number of aneuploid cells as the grade of the tumor increased. The number of aneuploid cells was also proportionate to the nuclear area measurements. Small nuclear areas were usually diploid, while larger ones were associated with more DNA and were aneuploid content. Such results indicated that cytophotometry may be a helpful adjuvant in routine histolopathological diagnosis, increasing the diagnostic accuracy and shedding light on the biological potential of the malignant cells

Cancer de mama y citometría de flujo: estudio comparativo del patrón de ploidia de ADN con parámetros anatomoclínicos / Breast cancer and flow cytometry: comparative study of DNA ploidy pattern with anatomoclinical parameters

There is evidence that DNA quantization and histopathological classification of breast cancer may be useful for its therapeutic management. DNA flow cytometry clinical and anatomopathological features of 60 paraffin embedded primary breast cancer tissue samples were studied. The aneuploidy percentage was 67 per cent . There was a correlation between DNA index and degree of cellular pleomorphism, degree of diferentiation and the fraction of cells in S phases. Likewisw a correlation was found between the degree of cellular pleomorphism and the mitotic index. DNA cytophotometry was useful to solve cases of difficult diagnosis with flow between aneuploidy, percentage of cells in phase S, degree of cellular atypia and mitotic degree with clinical stage, degree of lymph node involvement, tumoral size or age. It is suggested that these variables may have an independent behavior

Carcinoma papilífero da tireóide: a propósito da variante esclerosante difusa / Thyroid carcinoma: a propos of the diffuse sclerosing variant

O autor descreve os quadros anatomopatológico e clínico-epidemiológico da variante esclerosante difusa do carcinoma papilífero da tireóide, seguidos de proposta diagnóstica quanto aos achados citopatológicos, ao mesmo tempo que demonstra o perfil histoquímico das mucinas neutras e ácidas contidas na substância acinar. Através da imunohistoquímica define a fenotipagem da variante passando a admitir que o infiltrado linfocitário resulta de resposta do hospedeiro aos antígenos tumorais. A análise pela citofotometria evidencia que a variante esclerosante difusa tem em comparaçäo com o carcinoma papilífero comum uma média de maior área nuclear e proporcional aumento de massa relativa de ADN, o que permite considerá-la, ao lado de informaçöes clínicas, como de mau prognóstico. A história natural deste subtipo de carcinoma papilífero sugere terapêutica cirúrgica inicial täo radical quanto possível.