Estudo comparativo entre um sistema de sonda genética e métodos clássicos na identificação das micobactérias / Gene probes versus classical methods in the identification of mycobacteria

OBJETIVO: O aparecimento da co-infecção tuberculose/HIV e o aumento de casos de doenças provocadas por micobactérias não-tuberculosas (MNT) exigem repostas laboratoriais rápidas tanto no isolamento como na identificação das micobactérias. O objetivo deste trabalho foi avaliar a identificação das micobactérias através de sonda genética em comparação com os métodos bioquímicos clássicos. MÉTODOS: Entre 2002 e 2004, foram analisadas 178 culturas de micobactérias, confirmadas como bacilos álcool-ácido resistentes e obtidas de isolados clínicos de pacientes sintomáticos respiratórios ou com suspeita clínica de tuberculose pulmonar e/ou micobacterioses, atendidos nas Unidades de Saúde da Baixada Santista. RESULTADOS: A sonda genética identificou 137 amostras (77%) como complexo Mycobacterium tuberculosis e 41 (23%) como MNT. A discordância observada de 3% entre os métodos ocorreu apenas no ano de implantação (2002). Ao comparar os métodos, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo da sonda genética foram 98%, 93%, 98% e 93%, respectivamente. CONCLUSÕES: Apesar do custo elevado, a identificação de micobactérias pela técnica molecular é mais rápida: máximo de 3 h vs. 28-30 dias para os métodos clássicos. A utilização de sondas genéticas é uma técnica molecular validada, simples e disponível no mercado, com elevada especificidade, sensibilidade e rapidez, o que justifica sua implantação e uso rotineiro em laboratórios de referência, facilitando o diagnóstico e permitindo uma intervenção clínica ágil.

OBJECTIVE: The emergence of tuberculosis/HIV co-infection and the increase in the number of cases of infection with nontuberculous mycobacteria (NTM) require rapid laboratory test results in the isolation and identification of mycobacteria. The objective of this study was to evaluate the identification of mycobacteria by means of gene probes in comparison with that obtained using classical biochemical methods. METHODS: Between 2002 and 2004, 178 mycobacterial cultures, all testing positive for acid-fast bacilli, were analyzed. Samples were obtained from clinical specimens of patients with respiratory symptoms or with clinical suspicion of pulmonary tuberculosis/mycobacteriosis who were treated in the greater metropolitan area of Santos. RESULTS: The gene probe identified 137 samples (77%) as Mycobacterium tuberculosis complex and 41 (23%) as NTM. Discordant results between the methods (3%) were obtained only in the year of implementation (2002). When comparing the methods, the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the gene probe method were 98%, 93%, 98% and 93%, respectively. CONCLUSIONS: Despite the cost, the identification of mycobacteria using the molecular technique is faster: maximum 3 h vs. 28-30 days for classical methods. The use of gene probes is a validated molecular technique. It is fast, easy to use and readily available on the market. It has high specificity and sensitivity, which justifies its implementation and routine use in referral laboratories, since it facilitates the diagnosis providing agile clinical interventions.

Implementación de sondas genéticas biotiniladas para la identificación de E. coli diarreogénico en niños con diarrea / Implementation of biotinilates genetic probes for identification of E. coli diarreogenic in children with diarrhea

Escherichia coli constituye el agente etiológico más importante de la diarrea aguda infantil en los países en vías de desarrollo. Para la identificación de las distintas categorías y determinación de su importancia relativa en grandes poblaciones se ha requerido de técnicas sofisticadas y engorrosas. Como una respuesta a la necesidad de contar con una técnica de alta sensibilidad y especificidad, que no requiere de instalaciones costosas, ni un tiempo largo de procesamiento, se han desarrollado las sondas genéticas, como un aporte más del avance en la tecnología del ADN recombinante. De gran importancia fue poder reemplazar el uso de radioisótopos por sistemas de marca más simples y fáciles de manipular, como la biotina. Nuestro interés fue dar a conocer la experiencia de la implementación de esta tecnología en la identificación de las diversas categorías de E. coli diarreogénico en muestras de deposiciones de niños con diarrea y controles sanos, comoparte de un estudio de campo de la diarrea aguda. Demostrándose que es posible desarrollar esta tecnología en Chile y que los resultados obtenidos constituyen un aporte al conocimiento de la epidemiología de E. coli diarreogénico

Construcción de una sonda de DNA para identificar Adenovirus humanos

Fragmentos de restricción del DNA del Adenovirus humano tipo 8, fueron ligados al plásmido pBR322 a nivel del gen de resistencia a la tetraciclina y clonados en la E. coli HB101. El plásmido recombinante obtenido del clón bacteriano No. 117 fué seleccionado como sonda para realizar ensayos de hibridazación, utilizando marcaje radioactivo. Según análisis de restricción e hibridización, éste plásmido contiene un fragmento de DNA viral con una longitud aproximada de 4.65 Kb, que corresponde a la región del genoma localizada entre 55.1 y 68.8 um, la cual codifica para la proteina del hexón y para la proteina 55 Kd, que estáligada al extremo 5' del DNA viral. La sonda clonada fué evaluada mediante la técnica de hibridización "dot blot", empleando DNAs de Adenovirus representantes de los subgéneros A, B, C, D, y E. Los resultados permitieron concluir que la región del genoma Adenoviral localizada entre 55.1 y 68.8 um, contiene secuencias nucleotidicas homólogas en 5 diferentes subgéneros y por lo tanto podría utilizarse como sonda para detectar ácido nucleico a partir de muestras clínicas