Genomic study of Anopheles (Nyssorhynchus) aquasalis, Curry 1932. A Neotropical human malaria vector

A malária humana é uma doença provocada por parasitas do gênero Plasmodium, os quais na natureza requerem de um mosquito anofelíno para completar o seu ciclo de vida e serem transmitidos a um hospedeiro humano. Nas Américas, o Brasil tem a maior incidência de malária, sendo responsável por 41% dos casos. Com o aparecimento do sequenciamento de nova geração e das ferramentas bioinformática relacionados, grandes avanços foram alcançados em relação à montagem de genomas e transcriptomas de anofelinos, assim como na exploração de estratégias de paratransgenesis para interromper a transmissão da malária. No entanto, os vetores neotropicais da malária encontram-se longe dos vetores da África e Ásia no que refere a estes conhecimentos. Este estudo é parte de um esforço contínuo para montar o genoma do Anopheles aquasalis, um vetor neotropical da malária humana, que atualmente posiciona-se como um excelente modelo de transmissão da malária no Brasil. Em paralelo ao sequenciamento do genoma, e para maximizar os dados gerados, optamos por focar em duas tarefas pontuais e viáveis: explorar a diversidade e composição do consórcio bacteriano associado ao anofelino; assim como montar e caracterizar o genoma mitocondrial desta espécie.

O sequenciamento metagenômico ̈shotgun ̈ e o programa MG-RAST foram utilizados para fazer um ̈screening ̈ das bactérias associadas à pupas de A .aquasalis criadas em laboratório. O consórcio bacteriano predito é composto por 74 gêneros contendo bactérias marinhas e bioluminescentes. No nível taxonômico de família bacteriana, identificamos 14 OTUs compartilhadas entre anofelinos americanos e africanos. Além disso, foram comparadas cinco comunidades bacterianas associadas a duas espécies de anofelinos: A. aquasalis e Anopheles gambiae. Foi identificada uma associação significativa (NPMANOVA p <0,05) entre a composição da comunidade bacteriana e o ambiente aquático (laboratório ou condições semi-naturais) nas quais cada hospedeiro anofelino foi criado. Atualmente, o entendimento da filogenia do gênero Anopheles é limitado e as informações sobre o tempo de divergência dentro da linhagem de mosquitos é escassa.

Apresentamos a sequencia de 15,393 pb correspondente ao genoma mitocondrial de A. aquasalis. Quando comparado com outros mitogenomas anofelinos relevantes, observou-se alta similaridade na composição dos genomas assim como características estruturais conservadas. Através de análises Bayesianas, reconstruímos as relações filogenéticas e estimamos a data de divergência entre 22 anofelinos e outras espécies de dípteros. Descobrimos que o mais recente ancestral entre as subfamílias Nyssorhynchus e Anopheles +Cellia existiu ~ 83 milhões anos atrás (MYA). Estimou-se que A. aquasalis divergiu do complexo do Anopheles albitarisis faz ~ 28 MYA, e faz ~ 38 MYA do Anopheles darlingi. A distribuição estreita e o peculiar nicho ecológico do A. aquasalis, além de considerar a sua adaptação a ambientes larvários com água salobra fizeram nos perguntar se a sua história evolutiva deixou uma marca na arquitetura do seu genoma, assim como sobre a estrutura da comunidade bacteriana associada a este anofelino.

Estudo comparativo da variabilidade genética de Plasmodium vivax provenientes de infecções primáriae episódios de recaída após tratamento comPrimaquina e Cloroquina

A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium.Aproximadamente 40% da população mundial encontra-se em risco de infecção. NoBrasil foram registrados 333.339 casos da doença em 2010, sendo 85% delescausados pelo Plasmodium vivax. O P. vivax apresenta uma característicaimportante em seu ciclo de vida, a possibilidade de desenvolver formas latentes nofígado, os hipnozoítos, que podem causar episódios de recaída. Pouco se sabe arespeito dos mecanismos de latência e ativação dos hipnozoítos. Porém dados daliteratura relatam uma correlação entre cepa do parasito e padrão de recaída,sugerindo uma programação genética dos parasitos. A escassez de marcadoresgenéticos para P. vivax tem dificultado as análises de importantes fenótipos doparasito, tais como os padrões de recaídas

Nesse contexto, o objetivo do presentetrabalho foi estudar a variabilidade dos parasitos presentes nas infecções primáriase nos episódios de recaída. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientesforam genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares (08 microssatélites e osblocos 2 e 10 da MSP-1) através de eletroforese capilar em sequenciadorautomático de DNA. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foiconfirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados e genotipagem apartir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foidemonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos emrelação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelospredominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelospor marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentesepisódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste trabalhofoi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primáriascomo nas recaídas, pela primeira vez demonstrada, sendo que infecções múltiplaspuderam ser identificadas com apenas 5 marcadores. A presença de repetidasrecaídas após o tratamento cloroquina/primaquina pode sugerir presença deparasitos resistentes ao tratamento. Com estes resultados espera-se contribuir parao esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitosdas recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento otratamento e auxiliando no controle da doença

Aprimoramento da anotação N-terminal de proteínas através da predição de peptídeo sinal em proteínas ortólogase desenvolvimento de uma ferramenta automática para a identificação de grupos ortólogos contendo erros deanotação

O peptídeo sinal é um motivo encontrado, geralmente, na extremidade N-terminal deproteínas e a sua presença determina a entrada na via clássica de transporte intracelular,após a translocação da proteína para o lúmen do retículo endoplasmático. Portanto, apresença ou ausência do peptídeo sinal influencia a função biológica de uma proteína ao serum fator determinante da sua localização subcelular. Como a conservação de função entreproteínas ortólogas é esperada, foi hipotetizado que a localização subcelular e,consequentemente, a presença do peptídeo sinal deveriam, também, se apresentarconservadas. Partindo desta premissa, as predições de peptídeo sinal em proteínasortólogas de cinco espécies de Plasmodium foram analisadas.Predições de peptídeo sinal (SignalP) e informações de ortologia (OrthoMCL-DB)para proteínas de cinco espécies do gênero Plasmodium (Plasmodium falciparum,Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Plasmodium berguei e Plasmodium yoelii) foramcombinadas em uma estratégia inovadora, visando a identificação de grupos de proteínasortólogas que apresentam predições de peptídeo sinal divergentes (grupos Mistos).

Asproteínas pertencentes a estes grupos foram submetidas a uma análise comparativabaseada na inspeção visual de alinhamentos múltiplos e de modelos gênicos e regiõesgenômicas flanqueadoras da extremidade N-terminal. Novos modelos gênicos foramsugeridos para aquelas proteínas que apresentavam prováveis erros de anotação desequência, especialmente na região N-terminal. Alguns dos novos modelos gênicos foramvalidados por RT-PCR. Os resultados da inspeção visual foram usados para treinar umaMáquina de Suporte de Vetores (Support Vector Machine) com o objetivo de classificargrupos Mistos em: (1) Com erros de anotação ou (2) Sem erros de anotação. O SVM foiaplicado para classificar os grupos Mistos de cinco bancos de dados, montados a partir devinte e duas espécies.Os grupos contendo proteínas com predições de peptídeo sinal divergentesapresentaram uma alta taxa de erros de anotação. Um total de 478 proteínas dePlasmodium foram reanotadas sendo que a maioria apresentou inversões das suaspredições de peptídeo sinal originais, representando um impacto significativo no conjuntofinal de proteínas destinadas à via clássica de transporte intracelular, principalmente paraPlasmodium vivax e Plasmodium yoelii. O classificador baseado nos dados da inspeçãovisual se mostrou bastante flexível e robusto, apresentando uma performance boa econsistente mesmo frente a cenários variados de agrupamento de espécies.A metodologia proposta introduz uma abordagem simples, porém promissora, para arealização de tarefas de curadoria e controle de qualidade dos dados de anotação desequências proteicas em uma escala genômica. Os resultados do classificador definem a base para seu desenvolvimento em uma ferramenta computacional e os resultados dasreanotações em Plasmodium impactarão a busca por novos alvos vacinais equimioterápicos.

Aprimoramento da anotação N-terminal de proteínas através da predição de peptídeo sinal em proteínas ortólogase desenvolvimento de uma ferramenta automática para a identificação de grupos ortólogos contendo erros deanotação / Improved annotation of N-terminal protein through the prediction of signal peptide in orthologous proteins and developing a tool for automatic Identification of orthologs groups containing errors annotation

O peptídeo sinal é um motivo encontrado, geralmente, na extremidade N-terminal deproteínas e a sua presença determina a entrada na via clássica de transporte intracelular,após a translocação da proteína para o lúmen do retículo endoplasmático. Portanto, apresença ou ausência do peptídeo sinal influencia a função biológica de uma proteína ao serum fator determinante da sua localização subcelular. Como a conservação de função entreproteínas ortólogas é esperada, foi hipotetizado que a localização subcelular e,consequentemente, a presença do peptídeo sinal deveriam, também, se apresentarconservadas. Partindo desta premissa, as predições de peptídeo sinal em proteínasortólogas de cinco espécies de Plasmodium foram analisadas.Predições de peptídeo sinal (SignalP) e informações de ortologia (OrthoMCL-DB)para proteínas de cinco espécies do gênero Plasmodium (Plasmodium falciparum,Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Plasmodium berguei e Plasmodium yoelii) foramcombinadas em uma estratégia inovadora, visando a identificação de grupos de proteínasortólogas que apresentam predições de peptídeo sinal divergentes (grupos Mistos).

Asproteínas pertencentes a estes grupos foram submetidas a uma análise comparativabaseada na inspeção visual de alinhamentos múltiplos e de modelos gênicos e regiõesgenômicas flanqueadoras da extremidade N-terminal. Novos modelos gênicos foramsugeridos para aquelas proteínas que apresentavam prováveis erros de anotação desequência, especialmente na região N-terminal. Alguns dos novos modelos gênicos foramvalidados por RT-PCR. Os resultados da inspeção visual foram usados para treinar umaMáquina de Suporte de Vetores (Support Vector Machine) com o objetivo de classificargrupos Mistos em: (1) Com erros de anotação ou (2) Sem erros de anotação. O SVM foiaplicado para classificar os grupos Mistos de cinco bancos de dados, montados a partir devinte e duas espécies.Os grupos contendo proteínas com predições de peptídeo sinal divergentesapresentaram uma alta taxa de erros de anotação. Um total de 478 proteínas dePlasmodium foram reanotadas sendo que a maioria apresentou inversões das suaspredições de peptídeo sinal originais, representando um impacto significativo no conjuntofinal de proteínas destinadas à via clássica de transporte intracelular, principalmente paraPlasmodium vivax e Plasmodium yoelii. O classificador baseado nos dados da inspeçãovisual se mostrou bastante flexível e robusto, apresentando uma performance boa econsistente mesmo frente a cenários variados de agrupamento de espécies.A metodologia proposta introduz uma abordagem simples, porém promissora, para arealização de tarefas de curadoria e controle de qualidade dos dados de anotação desequências proteicas em uma escala genômica. Os resultados do classificador definem a base para seu desenvolvimento em uma ferramenta computacional e os resultados dasreanotações em Plasmodium impactarão a busca por novos alvos vacinais equimioterápicos.

Estudo comparativo da variabilidade genética de Plasmodium vivax provenientes de infecções primáriae episódios de recaída após tratamento comPrimaquina e Cloroquina / Comparative study of genetic variability of Plasmodium vivax from primary infection and episodes of relapse after treatment Chloroquine and Primaquine

A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium.Aproximadamente 40% da população mundial encontra-se em risco de infecção. NoBrasil foram registrados 333.339 casos da doença em 2010, sendo 85% delescausados pelo Plasmodium vivax. O P. vivax apresenta uma característicaimportante em seu ciclo de vida, a possibilidade de desenvolver formas latentes nofígado, os hipnozoítos, que podem causar episódios de recaída. Pouco se sabe arespeito dos mecanismos de latência e ativação dos hipnozoítos. Porém dados daliteratura relatam uma correlação entre cepa do parasito e padrão de recaída,sugerindo uma programação genética dos parasitos. A escassez de marcadoresgenéticos para P. vivax tem dificultado as análises de importantes fenótipos doparasito, tais como os padrões de recaídas. Nesse contexto, o objetivo do presentetrabalho foi estudar a variabilidade dos parasitos presentes nas infecções primáriase nos episódios de recaída. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientesforam genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares (08 microssatélites e osblocos 2 e 10 da MSP-1) através de eletroforese capilar em sequenciadorautomático de DNA. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foiconfirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados e genotipagem apartir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foidemonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos emrelação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelospredominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelospor marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentesepisódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste trabalhofoi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primáriascomo nas recaídas, pela primeira vez demonstrada, sendo que infecções múltiplaspuderam ser identificadas com apenas 5 marcadores. A presença de repetidasrecaídas após o tratamento cloroquina/primaquina pode sugerir presença deparasitos resistentes ao tratamento. Com estes resultados espera-se contribuir parao esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitosdas recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento otratamento e auxiliando no controle da doença.

Estudo comparativo da variabilidade genética de plasmodium vivax provenientes de infecções primáriae episódios de recaída após tratamento com primaquina e cloroquina / Comparative study of genetic variability of plasmodium vivax from primary infection and episodes of relapse after treatment chloroquine and primaquine

A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium.Aproximadamente 40% da população mundial encontra-se em risco de infecção. NoBrasil foram registrados 333.339 casos da doença em 2010, sendo 85% delescausados pelo Plasmodium vivax. O P. vivax apresenta uma característicaimportante em seu ciclo de vida, a possibilidade de desenvolver formas latentes nofígado, os hipnozoítos, que podem causar episódios de recaída. Pouco se sabe arespeito dos mecanismos de latência e ativação dos hipnozoítos. Porém dados daliteratura relatam uma correlação entre cepa do parasito e padrão de recaída,sugerindo uma programação genética dos parasitos. A escassez de marcadoresgenéticos para P. vivax tem dificultado as análises de importantes fenótipos doparasito, tais como os padrões de recaídas. Nesse contexto, o objetivo do presentetrabalho foi estudar a variabilidade dos parasitos presentes nas infecções primáriase nos episódios de recaída. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientesforam genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares (08 microssatélites e osblocos 2 e 10 da MSP-1) através de eletroforese capilar em sequenciadorautomático de DNA. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foiconfirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados e genotipagem apartir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foidemonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos emrelação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelospredominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelospor marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentesepisódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste trabalhofoi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primáriascomo nas recaídas, pela primeira vez demonstrada, sendo que infecções múltiplaspuderam ser identificadas com apenas 5 marcadores. A presença de repetidasrecaídas após o tratamento cloroquina/primaquina pode sugerir presença deparasitos resistentes ao tratamento. Com estes resultados espera-se contribuir parao esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitosdas recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento otratamento e auxiliando no controle da doença.

Sickle cell disease in Middle East Arab countries.

The sickle cell (HbS) gene occurs at a variable frequency in the Middle Eastern Arab countries, with characteristic distribution patterns and representing an overall picture of blood genetic disorders in the region. The origin of the gene has been debated, but studies using β-globin gene haplotypes have ascertained that there were multiple origins for HbS. In some regions the HbS gene is common and exhibits polymorphism, while the reverse is true in others. A common causative factor for the high prevalence and maintenance of HbS and thalassaemia genes is malaria endemicity. The HbS gene also co-exists with other haemoglobin variants and thalassaemia genes and the resulting clinical state is referred to as sickle cell disease (SCD). In the Middle Eastern Arab countries, the clinical picture of SCD expresses two distinct forms, the benign and the severe forms, which are related to two distinct β-globin gene haplotypes. These are referred to as the Saudi-Indian and the Benin haplotypes, respectively. In a majority of the Middle Eastern Arab countries the HbS is linked to the Saudi-Indian haplotype, while in others it is linked to the Benin haplotype. This review outlines the frequency, distribution, clinical feature, management and prevention as well as gene interactions of the HbS genes with other haemoglobin disorders in the Middle Eastern Arab countries.

Detection of mixed Plasmodium falciparum & P. vivax infections by nested-PCR in Pakistan, Iran & Afghanistan.

Background & objectives: Species identification and information on transmission pattern of malaria parasite in any malaria endemic area is key to success for a malaria control programme. In this investigation, malaria diagnosis using molecular method was used to assess the transmission pattern of malaria parasite in three malaria endemic regions: Afghanistan, Iran and Pakistan. Methods: Blood samples were collected from the patients presenting with vivax malaria from Afghanistan (n = 108), Iran (n = 200) and Pakistan (n = 199). Malaria parasite detection was made by the gold standard (microscopy) and also nested-PCR assay, using 18S small sub-unit ribosomal RNA (ssrRNA) gene. Results: Based on microscopy method, the level of mixed infection was zero to 2.5 per cent; however, nested-PCR assay detected 6.5, 22 and 23.5 per cent mixed infections in samples collected from Afghanistan, Iran and Pakistan, respectively. The present results showed that the co-infection of P. vivax with P. falciparum was frequent in malaria endemic regions of Iran and Pakistan. Interpretation & conclusion: The present data suggest the need for improving microscopy diagnosis method and the clinician should also have careful clinical observation, along with the reports on Giemsa-stained thick blood films, particularly in summer time when P. vivax is predominant. Also sharing information on transmission pattern of mixed infection among these countries may help in designing better control strategies for malaria.

Frequency of the HFE C282Y and H63D polymorphisms in Brazilian malaria patients and blood donors from the Amazon region

Malaria is an endemic parasitosis and its causitive agent, Plasmodium, has a metabolism linked to iron supply. HFE is a gene with the polymorphisms C282Y and H63D, which are associated with a progressive iron accumulation in the organism leading to a disease called hereditary hemochromatosis. The aim of the present study was to determine the allelic and genotypic frequencies of the HFE gene polymorphisms in malaria patients and blood donors from the Brazilian Amazon region. We screened 400 blood donors and 400 malaria patients for the HFE C282Y and H63D polymorphisms from four states of the Brazilian Amazon region by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. We did not find any C282Y homozygous individuals, and the only five heterozygous individuals detected were from Pará State. The most frequent genotype in the North region of Brazil was the H63D heterozygote, in both study groups. Our results contribute to the concept that the Brazilian Amazon region should not be regarded as a single entity in South America. These polymorphisms did not influence the symptoms of malaria in the population studied, as neither severe signs nor high parasitemia were observed. Therefore, different hereditary hemochromatosis diagnostic and control measures must be developed and applied within its diverse locations. Investigations are currently being carried out in our laboratory in order to determine the importance of the coexistence of hereditary hemochromatosis in patients affected by parasitic diseases, such as malaria.

[ study on single nucleotide polymorphisms in Plasmodium fakiparum chloroquine resistance during two years in Chabahar]

Plasmodium falciparum chloroquine resistance is a major problem in malaria endemic areas. Single nucleotide polymorphisms in pfcrt and pfmdr1 genes are known to be associated with chloroquine resistance in some parts of the world. The major goal of the present study was to detect the five single nucleotide polymorphisms in pfmdr1 gene and one single nucleotide polymorphisms in pfcrt gene. Total of 26 blood samples were collected from falciparum malaria infectious person with chloroquine failure in Chabahar, a harbor located in Sistan baluchestan during 2 years. Detection of single nucleotide polymorphisms were carried out by Real-Time PCR using Light CyclerTM hybridization probe assay. Our data showed that the pfmdr1 N86Y mutation was detected in 6[23%] samples. Although this mutation was not observed in the first year but in the second year it was substancial. In addition the pfcrt K76T mutation was detected in 11 samples [42.3%] of CVMNT haplotype, 7 samples [26.9%] of CVIET haplotype, 5 samples [19.2%] of SVMNT haplotype and 2 samples [7.6%] of SVIET haplotype. The mutations considerably have increased during 2 years. Our results showed single nucleotide polymorphisms in pfmdr1 and pfcrt genes. This could be considered as chloroquine resistance markers for malaria control in Chabahar

Malaria in Egypt, Saudi Arabia and Yemen: a clinical pilot study

Imported malaria is a health problem and needs continuous monitoring as many clinicians are not aware of it. In Yemen malaria is the main public health problem. Malaria cases were 16 in Almaza Military Fever Hospital, Cairo, 53 in Saudi Hospital at Pilgrimage, Yemen and in Saber Hospital at Aden, Yemen were studied. 9 cases [56.2%] of P. falciparum in Cairo were imported and 7 cases [43.8%] acquired P. vivax locally [October 2003 to July 2004]. They were all treated successfully by chloroquine. An imported case [6.3%] died by cerebral malaria due to delayed diagnosis. Five imported cases [31.3%] had severe malaria. In Pilgrimage, an infant [1.9%] had congenital malaria, 17 cases [32.1%] had severe malaria and 2 [3.8%] died by cerebral malaria. 43 patients [81.1%] had P. falciparum and 10 patients [18.9%] had P. vivax. All patients were treated by parenteral or oral quinine. In Aden, one patient [5%] suffered diarrhea without fever, early blood film was negative, and was positive later on. 18 cases [90%] had P. falciparum, 2 [10%] had P. vivax. 4 cases [20%] had severe malaria and a patient [5%] died by cerebral malaria. Patients in Aden severe cases were successfully treated by intramuscular artemether followed by oral Fansidar, and mild ones were treated by oral Quartem

An allele-specific polymerase chain reaction assay for the differentiation of members of the Anopheles culicifacies complex.

Anopheles culicifacies, the principal vector of malaria in India, is a complex of five cryptic species which are morphologically indistinguishable at any stage of life. In view of the practical difficulties associated with classical cytotaxonomic method for the identification of members of the complex, an allele-specific polymerase chain reaction (ASPCR) assay targeted to the D3 domain of 28S ribosomal DNA was developed. The assay discriminates An. culicifacies species A and D from species B, C and E. The assay was validated using chromosomally identified specimens of An. culicifacies from different geographical regions of India representing different sympatric associations. The assay correctly differentiates species A and D from species B, C and E. The possible use of this diagnostic assay in disease vector control programmes is discussed.