Ensamble subcelular de la ribonucleoproteína Ro de 60 kDa a los hYRNAs / Subcellular assemble of the ribonucleoproteínas Ro 60 kDa a the hYRNAs

Ro es un complejo molecular de tres ribonucleoproteínas de 60, 54 y 52 kDa de las que la isoforma de 60 kDa está asociada a uno o varios hYRNAs; se sabe que su ensamble ocurre en el núcleo y en forma de complejo Ro/hYRNA es rápidamente exportado al citoplasma. Este trabajo fue diseñado para determinar si la unión de hYRNA es indispensable para la permanencia nuclear de la proteína Ro de 60 kDa. La interacción entre Ro y hYRNA fue estudiada por inmunofluorescencia y Western blot usando células HEp-2 y anticuerpos anti-Ro. La ribonucleoproteína Ro se localizó en los compartimientos núcleo-citoplásmicos con un patrón granular fino. Para definir si la presencia de hYRNA era esencial en la localización nuclear de Ro se realizaron experimentos adicionales de fluorescencia en células digeridas con RNAasa o tripsina con los siguientes hallazgos. La proteína Ro puede detectarse en el núcleo en ausencia de los hYRNAs, en tanto que su presencia citoplásmica necesariamente está ligada a los hYRNA, ya que la digestión con RNAasa abolió su expresión en citoplasma. El patrón de fluorescencia citoplásmico fue restaurado al reconstituír las células con extractos celulares ricos en hYRNAs. La digestión con tripsina eliminó por completo los gránulos núcleo-citoplásmicos de Ro. Se puede concluir que existen dos pooles nucleares de ribonucleoproteína Ro de 60 kDa, libre y en complejo, en tanto que en el citoplasma solamente existe formando complejos con los hYRNAs

Clonación molecular de Ro/SSA de 60 kD

Se identificaron 12 clonas del cDNA que codifica para el antígeno Ro de 60 KD, utilizando una biblioteca de cDNAs de bazo humano normal insertada en fagos gt11, sus productos de traducción inmovilizados en filtros recombinantes fueron reconocidos exclusivamente por un suero anti-Ro; otros sueros con diferentes especificidades, resultaron negativos. Dos de estas clonas fueron estudiadas con mayor detalle: Ro-531 y Ro-832, ambas fueron amplificadas por PCR y solamente Ro-531 fue subclonada en el polylinker pBK-II; el análisis con enzimas de restricción reveló que el ingerto tiene una longitud aproximada de 1 kb. Por transcripción in vitro se sintetizó una sonda de cRNA que hibridó por Southern blot con el DNA de Ro-531, de los lisógenos Y1089/Ro.531, y de pBK-II/Ro.531, pero no con Ro-832. En síntesis, se ha aislado un fragmento que corresponde al 55 por ciento del gene, que codifica para el antígeno Ro de 60 KD(AU)**********ojo