Polimorfismos en los genes de dihidrofolato-reductasa ( dhfr ) y dihidropteroato-sintasa ( dhps ) y modelado estructural del gen dhps en aislamientos colombianos de Toxoplasma gondii / Gene polymorphisms in the dihydrofolate reductase ( dhfr ) and dihydropteroate synthase ( dhps ) genes and structural modelling of the dhps gene in Colombian isolates of Toxoplasma gondii

Introducción. No existen reportes sobre las variaciones en la secuencia de los genes blanco de los medicamentos anti- Toxoplasma en aislamientos provenientes de Suramérica. Objetivo. Clonar y secuenciar los genes de la dihidrofolato-reductasa ( dhfr ) y la dihidropteroato-sintetasa ( dhps ) de la cepa de referencia RH y de dos aislamientos colombianos de Toxoplasma gondii. Materiales y métodos. Se obtuvieron dos aislamientos de T. gondii en líquido céfalorraquídeo de pacientes colombianos positivos para HIV con toxoplasmosis cerebral. Se extrajo el ADN de los genes dhfr y dhps y se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los productos fueron clonados en el vector pGEM-T y secuenciados. Resultados. Se encontró un cambio de adenina por guanina (A « G) en la posición 235 del exón 2 del gen dhps , dos cambios de guanina por citocina (G « C) en las posiciones 259 y 260 y un cambio de timina por guanina (T « G) en la posición 371 del exón 4 del gen dhps. Por análisis bioinformático, en este último exón se identificó un polimorfismo no sinónimo en la región codificante, que podría llevar al cambio de una Glu (CAA o CAG) por una His (codificada por los codones AAU o AAC). Se calculó el modelo estructural de la enzima dihidropteroato-sintetasa (DHPS) de T. gondii y se identificaron las modificaciones en la estructura secundaria ocasionadas por las mutaciones. Conclusiones. La metodología estandarizada puede servir como base para la búsqueda de polimorfismos en muestras de pacientes con diferentes manifestaciones clínicas de toxoplasmosis y para establecer su posible relación con los cambios en la sensibilidad a los antifolatos y la reacción al tratamiento.

Introduction: There are no reports describing polymorphisms in target genes of anti- Toxoplasma drugs in South American isolates. Objective: This study sought to perform cloning and sequencing of the dihydrofolate reductase ( dhfr ) and dihydropteroate-synthase ( dhps ) genes of the reference Rh strain and two Colombian isolates of Toxoplasma gondii . Materials and methods: Two isolates were obtained from the cerebrospinal fluid of HIV-infected patients with cerebral toxoplasmosis. A DNA extraction technique and PCR assay for the dhfr and dhps genes were standardized, and the products of amplification were cloned into Escherichia coli and sequenced. Results: One polymorphism (A « G) was found at position 235 of exon 2 in the dhps gene. In addition, two polymorphisms (G « C) at positions 259 and 260 and one polymorphism (T « G) at position 371 within exon 4 of the dhps gene were detected. In this last exon, a bioinformatic analysis revealed a non-synonymous polymorphism in the coding region that could lead to the substitution of Glu (CAA or CAG) for His (encoded by codons AAU or AAC). A structural model of the T. gondii DHPS protein was calculated, and the results revealed modifications in secondary structure due to mutations. Conclusions: The methods described in this study can be used as a tool to search for polymorphisms in samples from patients with different clinical manifestations of toxoplasmosis and to examine their relationship with the therapeutic response.

Features to validate cerebral toxoplasmosis

Introduction Neurotoxoplasmosis (NT) sometimes manifests unusual characteristics. Methods We analyzed 85 patients with NT and AIDS according to clinical, cerebrospinal fluid, cranial magnetic resonance, and polymerase chain reaction (PCR) characteristics. Results In 8.5%, focal neurological deficits were absent and 16.4% had single cerebral lesions. Increased sensitivity of PCR for Toxoplasma gondii DNA in the central nervous system was associated with pleocytosis and presence of >4 encephalic lesions. Conclusions Patients with NT may present without focal neurological deficit and NT may occur with presence of a single cerebral lesion. Greater numbers of lesions and greater cellularity in cerebrospinal fluid improve the sensitivity of PCR to T gondii. .

Neurotoxoplasmosis diagnosis for HIV-1 patients by real-time PCR of cerebrospinal fluid

Encephalitis caused by Toxoplasma gondii is the most common cause of central nervous system damage in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Toxoplasma may infect any of the brain cells, thus leading to non-specific neurotoxoplasmosis clinical manifestations including focused or non-focused signs and symptoms of central nervous system malfunction. Clinical development ranges from insidious display during weeks to experiencing acute general confusion or ultimately fatal onset. Cerebral toxoplasmosis occurs in advanced stages of immunodeficiency, and the absence of anti-toxoplasmosis antibodies by the immunofluorescence method does not allow us to rule out its diagnosis. As specific therapy begins, diagnosis confirmation is sought through clinical and radiological response. There are few accurate diagnosis methods to confirm such cases. We present a method for T. gondii DNA detection by real time PCR-Multiplex. Fifty-one patients were evaluated; 16 patients had AIDS and a presumptive diagnosis for toxoplasmosis, 23 patients were HIV-positive with further morbidities except neurotoxoplasmosis, and 12 subjects were HIV-negative control patients. Real time PCR-Multiplex was applied to these patients' cephalorachidian liquid with a specific T. gondii genome sequence from the 529bp fragment. This test is usually carried out within four hours. Test sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were calculated according to applicable tables. Toxoplasma gondii assay by real time Multiplex of cephalorachidian fluid was positive for 11 out of 16 patients with AIDS and a presumptive diagnosis for cerebral toxoplasmosis, while none of the 35 control patients displayed such a result. Therefore, this method allowed us to achieve 68.8 percent sensitivity, 100 percent specificity, 100 percent positive predictive value, and 87.8 percent negative predictive value. Real time PCR on CSF allowed high specificity...

Estudo retrospectivo dos exames de líquido cefalorraquidiano (LCR) de / Retrospective study on cerebrospinal fluid (CSF) evaluation in HIV positive-patients with clinically suspected neurotoxoplasmosis

A toxoplasmose é uma infecção comum, observada tanto em indivíduos sadios como em pacientes imunocomprometidos. Este trabalho tem como objetivo apresentar um estudo retrospectivo dos resultados obtidos de exames realizados no Instituto Adolfo Lutz, laboratório Regional de Sorocaba, no período de 01/01/2003 a 29/11/2004 em amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes HIV positivos com sintomatologia clínica e suspeita de neurotoxoplasmose, atendidos no Conjunto Hospitalar de Sorocaba (CHS). Selecionamos 109 pacientes HIV positivos, onde foi realizada a técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI) para pesquisa de anticorpos IgG contra Toxoplasma gondii no LCR. Dos 109 pacientes HIV positivos selecionados, 46 foram do sexo feminino e 63 do sexo masculino, cuja faixa etária de maior freqüência foi de 21 a 40 anos. Nenhuma paciente era gestante. Dos 46 pacientes femininos, 48% apresentaram anticorpos anti-Toxoplasma gondii e dos 63 pacientes masculinos, 36,5% apresentaram positividade. O número de exames realizados que apresentaram resultados positivos no ano de 2003 foi de 61,5%, e em 2004 até o período estudado, foi de 38,5%. Os resultados mostram que é importante o acompanhamento de todos os pacientes portadores de HIV, mesmo os que apresentam ausência de anticorpos no LCR, pois podem ter a atividade baixa do toxoplasma no SNC, sem manifestação clínica aparente. Assim, seria oportuno realizar o segmento destes pacientes a fim de determinar sinais de reativação da doença no futuro

Evaluación de la técnica de PCR en la detección de toxoplasmosis encefálica en pacientes con inmunodeficiencia

La Toxoplasmosis encefálica (TE) es una de las infecciones oportunistas más comunes en personas con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, se ha estimado que la tercera parte de estos pacientes desarrollan TE, siendo la mayoría de los casos producto de una reactivación endógena de una infección latente por Toxoplasma gondii, sin embargo la serología no es un marcador lo suficiente sensible para el diagnóstico de TE. Los métodos diagnósticados utilizados son coloraciones con Giemsa de fluídos corporales, inoculación en ratones, cultivos celulares pero tienen baja sensibilidad, también se puede realizar por biopsia de cerebro, pero implica peligro al paciente. A fin de superar estos problemas en el presente trabajo se ha evaluado la utilización de la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) para el diagnóstico de TE en diferentes muestras clínicas, usando "Primers" derivados del Gen B1 del parásito. Se usó como referencia o "Gold standard" la inoculación en ratones y/o el diagnóstico clínico. Se trabajó con una población de 68 pacientes divididos en tres grupos, uno de pacientes sospechosos (24 pacientes) y los otros dos de controles negativos (44 pacientes) las muestras que se evaluaron fueron líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre. Utilizando ya sea LCR o sangre la sensibilidad fue de 67 por ciento (8/12, 6/9) y cuando fue posible utilizar ambas muestras del mismo paciente, la sensibilidad se incrementó al 89 por ciento (8/9). La especificidad fue del 100 por ciento. El 77.7 por ciento (7/9) de los pacientes positivos a PCR presentaron anticuerpos contra t.gondii. Los niveles de CD4 por debajo de 200 células por µL de sangre predisponen al paciente a la adquisición de TE y otras enfermedades. El número de muestras trabajadas fue muy pequeño, no obstante esta limitación, consideramos como un importante aporte la iniciación del uso del PCR para el diagnóstico de Toxoplasma.

Toxoplasmosis encefálica en Sida / Encephalic toxoplasmosis in AIDS

La encefalitis toxoplásmica es la complicación oportunista del SNC que con mayor frecuencia ocasiona manifestaciones neurológicas focales en personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Desde 1986, cuando se diagnosticó el primer caso de toxoplasmosis encefálica en el sindrome de inmunodeficiencia adquirida (Sida) en nuestro país, hasta enero de 1997, en la Clínica y Servicio de Enfermedades Infecciosas (CEI-SEIC) se han observado 40 casos de esta enfermedad. La inaccesibilidad a ciertas técnicas diagnosticas y la imposibilidad de realizar autopsias en nuestro medio, hacen que esta complicación esté seguramente subdiagnosticada. La encefalitis toxoplásmica es sospechada por el cuadro clinico-tomográfico y reafirmada por la respuesta favorable al tratamiento. En 1 caso se tuvo la confirmación del diagnóstico por cultivo del germen que fue aislado del LCR. La mayoría de los enfermos tuvieron fiebre y manifestaciones neurológicas focales. Ante la sospecha clínica se realizó tomografía axial computada (TAC) de cráneo, la que se hizo en forma urgente, con la finalidad de iniciar precozmente el tratamiento específico y mejorar el pronóstico. Todos los casos presentaron lesiones características. En 1 sin lesiones tomográficas focales se hizo diagnóstico de encefalitis toxoplásmica difusa. En 27, a los que se les practicó estudio serológico de anticuerpos lgG específicos antitoxoplasma los resultados fueron positivos con títulos variables. En 20 enfermos en quienes se realizó estudio de subpoblaciones linfocitarias todos tenían un estado severo de inmunodepresión. En un alto porcentaje de casos se comprobaron otras infecciones oportunistas concomitantes. Con la sospecha diagnóstica se inició el tratamiento específico. Se observaron reacciones adversas a las drogas en 6 casos. Finalizado el período de tratamiento de la enfermedad activa, se continuó con terapia supresiva, observándose recaídas en 6 enfermos que lo habían discontinuado. Para prevenir esta grave complicación que compromete la vida del enfermo está indicado realizar quimioprofilaxis especialmente en aquellos con serología positiva para toxoplasmosis cuando su estado de inmunodepresión es grave, mientras que no es considerada prioritaria en los seronegativos para toxoplasma, en quienes la frecuencia de neurotoxoplasmosis es escasa

Detection of Toxoplasma gondii antigen in cerebrospinal fluid samples using a dot-enzyme-linked immunosorbent assay

Toxoplasma encephalitis (TE) is the most common manifestations of a recurrent Toxoplasma gondii infection in immunocompromised individuals, especially in AIDS patients. The infection is associated with considerable morbidity and mortality, even with improved diagnostic procedures and adequate treatment. The diagnosis of TE is difficult to establish by the demonstration of the parasite in the central nervous system or in cerebrospinal fluid (CSF). In order to diagnose TE we have developed a TGA-Dot-ELISA for antigen detection using rabbit anti-toxoplasma antiserum. We have applied this test to specimens of cerobrospinal fluid from patients with toxoplasma encephalitis (180 patients), neurocysticercosis (15), or bacterial meningitis (15). The relative sensitivity and specificity obtained for the TGA-Dot-ELISA were 0.930 and 0.730, respectively. TGA-Dot-ELISA is a promising method for the rapid diagnosis and effective prophylaxis of toxoplasma encephalitis.