Análisis proteómico de los productos de excreción-secreción de cuatro aislados de Trichinella spiralis obtenidos de hospederos accidentales / Proteomic analysis of the excretion-secretion products of four Trichinella spiralis isolates obtained from accidental hosts

Resumen: Introducción: Trichinella spiralis es un nemátodo tisular que se aloja en el músculo esquelético de humanos y otros mamíferos y causa una serie de alteraciones fisiológicas. Las proteínas de los productos de excreción-secreción de T. spiralis juegan un papel importante en la aparición y regulación de estas alteraciones. Sin embargo, aún no se conoce el efecto de estos productos en la infección e invasión del parásito al hospedero. Métodos: Mediante un análisis electroforético en una dimensión, Western blot y espectrometría de masas, se evaluaron las diferencias y similitudes entre proteínas antigénicas y de superficie de cuatro aislados de T. spiralis obtenidos de hospederos accidentales (perros) y la cepa de referencia aislada de cerdos (MSUS/MEX/91/CM). Resultados: Utilizando ontología de genes, se encontraron cinco proteínas exclusivas de los hospederos accidentales. Después del análisis, se encontró que estas proteínas forman parte de la matriz extracelular del parásito, cuentan con actividad catalítica y están implicadas en la adhesión a las células del hospedero. La actividad antigénica de las cuatro cepas aisladas de hospederos accidentales es idéntica a la reportada para T. spiralis, visualizándose el triplete antigénico característico de 43, 45 y 47 kDa. Conclusiones: Las proteínas exclusivas de los hospederos accidentales proveen información para entender el mecanismo de acción de este parásito para penetrar el músculo y evadir la respuesta inmune en el hospedero.

Abstract: Background: Trichinella spiralis is an intestinal and tissue nematode specific for mammalian skeletal muscle, causing a series of physiological alterations. T. spiralis excretory-secretion products play an important role in the appearance and regulation of these alterations. However, the effect of these products on the infection and invasion of the parasite to the host is unknown. Methods: Differences and similarities between antigenic proteins and surface proteins of four accidental hosts isolates (dogs) of T. spiralis and the reference strain isolated from pigs (MSUS/MEX/91/CM) were assessed by electrophoresis, western blot and mass spectrometry. Results: Using gene ontology, five proteins exclusive to the accidental hosts were analyzed. The results showed that these proteins are part of the extracellular matrix of the parasite, present catalytic activity, and bind to host cells. The antigenic activity the four strains showed the antigenic triplet characteristic of T. spiralis of 43, 45 and 47 kDa. Conclusions: Five proteins exclusive to dog isolates provided information to understand the mechanism of action of this parasite to penetrate the muscle and evade the immune response in the host.

STAT6 Expression and IL-13 Production in Association with Goblet Cell Hyperplasia and Worm Expulsion of Gymnophalloides seoi from C57BL/6 Mice

In intestinal helminth infections, Th2 immune respones are generally associated with mucin secretion for worm expulsion from the host intestine. In particular, IL-4 and IL-13 are the important cytokines related with intestinal mucus production via STAT6 signalling in nematode infections. However, this perspective has never been studied in Gymnophalloides seoi infection. The present study aimed to observe the STAT6 signalling and cytokine responses in C57BL/6 mice, a mouse strain resistant to infection with this trematode. The results showed that worm expulsion occurred actively during days 1-2 post-infection (PI), when goblet cells began to proliferate in the small intestine. The STAT6 gene expression in the mouse spleen became remarkable from day 2 PI. Moreover, G. seoi infection induced a significant increase of IL-13 from day 4 PI in the spleen of infected mice. Our results suggested that goblet cell hyperplasia and worm expulsion in G. seoi-infected mice should be induced by STAT6 signalling, in which IL-13 may be involved as a dominant triggering cytokine.

Trichinella spiralis Infection Suppressed Gut Inflammation with CD4+CD25+Foxp3+ T Cell Recruitment

In order to know the effect of pre-existing Trichinella spiralis infection on experimentally induced intestinal inflammation and immune responses, we induced colitis in T. spiralis-infected mice and observed the severity of colitis and the levels of Th1, Th2, and regulatory cytokines and recruitment of CD4+CD25+Foxp3+ T (regulatory T; Treg) cells. Female C57BL/6 mice were infected with 250 muscle larvae; after 4 weeks, induction of experimental colitis was performed using 3% dextran sulfate sodium (DSS). During the induction period, we observed severity of colitis, including weight loss and status of stool, and evaluated the disease activity index (DAI). A significantly low DAI and degree of weight loss were observed in infected mice, compared with uninfected mice. In addition, colon length in infected mice was not contracted, compared with uninfected mice. We also observed a significant increase in production of pro-inflammatory cytokines, IL-6 and IFN-gamma, in spleen lymphocytes treated with DSS; however, such an increase was not observed in infected mice treated with DSS. Of particular interest, production of regulatory cytokines, IL-10 and transforming growth factor (TGF)-beta, in spleen lymphocytes showed a significant increase in mice infected with T. spiralis. A similar result was observed in mesenteric lymph nodes (MLN). Subsets of the population of Treg cells in MLN and spleen showed significant increases in mice infected with T. spiralis. In conclusion, T. spiralis infection can inhibit the DSS-induced colitis in mice by enhancing the regulatory cytokine and Treg cells recruitment.

Protease-Activated Receptor 2 Is Involved in Th2 Responses against Trichinella spiralis Infection

In order to get a better understanding of the role of protease-activated receptor 2 (PAR2) in type 2 helper T (Th2) cell responses against Trichinella spiralis infection, we analyzed Th2 responses in T. spiralis-infected PAR2 knockout (KO) mice. The levels of the Th2 cell-secreted cytokines, IL-4, IL-5, and IL-13 were markedly reduced in the PAR2 KO mice as compared to the wild type mice following infection with T. spiralis. The serum levels of parasite-specific IgE increased significantly in the wild type mice as the result of T. spiralis infection, but this level was not significantly increased in PAR2 KO mice. The expression level of thymic stromal lymphopoietin, IL-25, and eotaxin gene (the genes were recently known as Th2 response initiators) of mouse intestinal epithelial cells were increased as the result of treatment with T. spiralis excretory-secretory proteins. However, the expression of these chemokine genes was inhibited by protease inhibitor treatments. In conclusion, PAR2 might involve in Th2 responses against T. spiralis infection.

Evaluación del efecto protector de 2 inmunógenos de Trchinella spiralis en ratas Long Evans con modificación nutricional e infectado con Trichinella spiralis / Evaluation of the protective effect of 2 inmunogenos of Trchinella spiralis in rats Long Evans with nutritional modification and infected with Trichinella spiralis

La Trichinellosis es una zoonosis endémica, cosmopolita, sus huéspedes son, ratas, cerdo y otros mamíferos entre ellos el hombre, la presencia de Trichinellosis se debe a la ingestión de carne de cerdo insuficientemente cocinada, afecta a países con bajos recursos económicos. Se han caracterizado Inmunógenos, siendo el inmunodominante el de 45 kDa, efectivo contra T. spiralis, desafortunadamente no ha cristalizado en una vacuna. Se han descrito efectos de desnutrición (DN) sobre órganos linfáticos. Los mecanismos de defensa del huésped son alterados con DN proteico-calórico (DPC). Evaluar el efecto protector de 2 inmunógenos de T. spiralis en ratas Long Evans con modificación Nutricional e infectado con T. spiralis. 80 ratas Long Evans de 30 días de edad, divididas en 2 grupos: 40 Nut con 24 de proteína y 40 DN con 12 de proteína de los cuales se subdividieron en 8 sub grupos con tratamiento: a) 10 animales control b)10 animales infectados con T. spiralis, c) 10 animales inmunizados con antígeno soluble total (AST), d) 10 animales inmunizados con inmunógeno de 45 kDa de T. spiralis (esquema de inmunización una aplicación cada semana por 4 ocasiones), retados a la 1era semana de la culminación de inmunización, sacrificadas a la 6 sexta semana post-infección. Parámetros a evaluar: Determinación de la carga parasitaria mediante la Digestión Artificial (D/A), Determinación de las características morfológicas de la célula nodriza por la técnica de compresión de tejidos, detección de la respuesta inmune por WB. Con la técnica de D/A, se obtuvieron en los diferentes tratamientos, de las ratas Nut, DN, Inmunizadas e Infectadas. Mostró diferencia significativa en la cantidad de Ll que se presentaron en 30gr de músculos estriado, los grupos controles de ratas Nut y DN sin infección, ausencia de Ll, y en los grupos de ratas Nut infectadas, se recolectaron 200 µl de Ll, para el grupo de DN infectado se recolecto 400 µl de Ll, en el grupo de Nut inmunizadas con AST.

Efecto de la temperatura en la viabilidad e infectividad de Trichinella spiralis / Effect of the temperature in the viability and infectividad of Trichinella spiralis

Trichinella spiralis es el parásito causante de la Trichinellosis una zoonosis endémica en nuestro estado la cual afecta a mamíferos entre ellos el humano. La principal causa de infección para este es el consumo de carne mal cocida de cerdo infectada con la larva infectante (LI) de T. spiralis. El propósito de este trabajo es determinar el efecto que tiene la temperatura sobre este parásito para poder proporcionar a la población medidas profilácticas las cuales se puedan poner en práctica de manera sencilla y económica contra esta enfermedad. Material y Métodos: En este estudio se utilizaron 2 modelos experimentales: A) 2 cerdos raza York de 6 meses de edad (control y problema) el control sin infección y un problema infectado con T. spiralis para evaluar el efecto de la temperatura (cocción, frita, horno de microondas, olla de presión, refrigeración y congelación) en la viabilidad e Infectividad por medio de digestión artificial para obtener paquete larvario y observación directa al microscopio por compresión para observar sus características físicas y B) 3 ratas Long Evans se inocularon con muestras de carne (de cada procesamiento de temperatura) infectada obtenida del modelo de cerdo en cuánto a los resultados de los procedimientos empleados a temperaturas altas (cocción y frita) por compresión en la cocción a 96ºC la viabilidad dió positiva hasta los 30 min. Después de este tiempo sus características no fueron viables (sus características físicas se observaron alteradas), en cuánto a la Infectividad (capacidad de completar su ciclo vital), se observó positiva hasta el minuto 30, después de este tiempo la Infectividad fue negativa. Al observar los resultados obtenidos podemos concluir que T. spiralis es un parásito con gran capacidad de resistencia a condiciones extremas de temperatura, siendo efectivo el cocimiento de la carne en la olla de presión a los 30 minutos la infectividad y viabilidad fue negativa, en caso de no contar con la olla de presión.

Cross-protection induced by cross-reactive antigen against Fasciola gigantica and Trichinella spiralis infections

Trichinella spiralis/Fasciola gigantica cross-reactive fraction was purified from T. spiralis larval extract by affinity column chromatography in which CNBr-Sepharose 4B was coupled with F. gigantica antibodies. The fraction consisted of six polypeptides of 191KDa, 178KDa, 149KDa, 106KDa. 101 KDa and 32KDa as revealed by SDS-PAGE. Analysis of the free amino acids of the fraction revealed 17 amino acids with high proportions of tyrosine and glutamic. Immunization of rabbits subcutaneously with the cross-reactive fraction in Freund's adjuvant, followed by challenge with F. gigantica metacercariae resulted in reduction in worm burdens reached to 47.8%. While, immunization of rats with the same fraction in Freund's adjuvant, followed by infection with T. spiralis larvae resulted in reduction in worm count reached to 74%. IgG antibody response in rabbits increased due to immunization to reach its maximum value at the time of infection and then decreased gradually up to the end of the experiments; but remained higher than the level in non vaccinated control animals. In rat sera, IgG level increased due to vaccination but the level recorded its optimum value one week post infection and then decreased. Thus, the cross-reactive antigen proved cross-protection with the protection inducing capability against both diseases

Uso de complejos inmunes para conferir protección en trichinellosis / Immune complexes in trichinellosis protection

El presente trabajo se llevó a cabo en modelo experimental murino se utilizaron 60 ratones Balb/c de 3 meses de edad, los cuales fueron inmunizados con bandas de precipitación obtenidas de complejos inmunes formados por la interacción de antígeno-anticuerpo de triquina, las cuales fueron eluidas con Buffer de barbital pH 8,6, el esquema de inmunización fue aplicar 10 mg de proteína cada 7 días por 4 ocasiones vía subcutánea, a la cuarta semana fueron retados con aproximadamente 100 larvas infectantes (Ll) de T. spiralis por vía oral y se sacrificaron a la cuarta semana post-infección, se obtuvo suero pre-inmunización, de la cuarta semana post-inmunización y de la cuarta semana post-inoculación con Ll de T. spiralis, para determinar la presencia de anticuerpos se realizó Dot-Elisa y Western Blot (WB). El tejido muscular obtenido del sacrificio de los animales experimentales y control se analizó por microscopio óptico. Por Dot-Elisa a la cuarta semana de post-inmunización de los 60 ratones, 50 resultaron positivos hasta títulos de 1:1020, y el grupo control de 10 ratones fue negativo. Por WB a la cuarta semana post-inmunización todos los animales inmunizados presentaron una banda de 45 kDa y el grupo control fue negativo, en los sueros post-inoculación de la semana de sacrificio todos los animales presentaron bandas en un promedio de 7 y predominio en la de 45 kDa, la carne de los inmunizados tuvo menor número de Ll que el grupo control. En conclusión la inmunización con complejos inmunes de T. spiralis despertó una respuesta inmune humoral y probablemente un efecto protector al impedir el implante de las larvas infectantes (Ll) de T. spiralis

Immunization of laboratory animals with ultraviolet-attenuated larvae against homologous challenge infection with Trichinella britovi.

Immunogenicity of Trichinella britovi (Japanese isolate, cord ISS 408) muscle larvae irradiated with 5 mJ/cm2 of short wavelength ultraviolet (UV) was studied using homologous challenge infections. SCID mice vaccinated with UV-attenuated larvae showed no resistance, although its congenic CB-17 mice exhibited remarkable immunity. Following challenge vaccinated Mongolian gerbils, Meriones unguiculatus, did not show significant immunity. Use of these animal models vaccinated with UV-attenuated larvae will contribute to the investigation of immune mechanisms against Trichinella infection and also to the development of a vaccine of trichinellosis.

Técnicas inmunoenzimáticas en el diagnóstico de la trichinellosis porcina / Immunoenzymatic assays in the diagnosis of swine trichenellosis

Se estandarizó un protocolo de ELISA como técnica de diagnóstico de la triquinosis porcina. Se verificó la parasitosis, en cerdos alimentados con diferentes dosis de carne de ratas infectadas con larvas de triquina, a los 30 y 60 días postinfección. No se observaron diferencia de porcentaje por distribución normal, no mostró diferencias significativas entre los valores de densidad óptica a 490 nm entre los sueros de cerdos infectados con una misma dosis de carne a los 30 y 60 días postinfección. Resultados similares se obtuvieron con los sueros de cerdos infectados con una misma dosis de carne a los 30 y 60 días postinfección. Resultados similares se obtuvieron con los sueros de animales infectados con diferentes dosis de carne. Estos sueros constituyeron controles positivos de infección para triquinosis porcina y se utilizaron para identificar epítopes antigénicos característicos de esta parasitosis. Por SDS-PAGE se caracterizó el componente peptídico del extracto crudo de proteínas de larvas de Trichinella spiralis. Se identificaron 10 péptidos, cuya movilidad electroforética se determinó por el programa computacional "Gel-perfect".Por electroinmuno transferencia se identificaron 4 polipéptidos de 77, 66, 47 y 43 KDa. Los polipéptidos de 47 y 43 KDa que presentan una señal más intensa,no fueron encontrados en los preparados antigénicos de Cysticercus cellulosae y líquido de quiste hidatídico. Dichos polipéptidos son detectados desde los 30 días postinfección con una intensidad de señal permanente en el tiempo e independiente de la dosis de infección de los cerdos

Production specific antigens from Trichinella spiralis using a continuous elution method and isoelectric focusing.

Immunodominant antigens of 45-53 kDa (one band per fraction) were obtained from excretory/secretory (E/S) and somatic products of infective-larvae of Trichinella spiralis using a continuous-elution method. They were further resolved by isoelectric focusing into different isoforms (45 kDa: pI4.47, 5.09, 5.47 and 5.86; 47 kDa: pI4.72 and 4.97; 53 kDa: pI4.86, 5.11, 5.44 and 5.78). In immunoblotting, the isoforms of pI 5.09, 5.86, 4.97, 5.44 and 5.78 did not cross-react with antisera against Trichuris suis, Metastrongylus apri, Gnathostoma hispidum and Stephanurus dentatus. Hence, they have the potential to serve as specific antigens for the serodiagnosis of trichinellosis.

Valor diagnóstico de la ELISA-IgG para triquinosis usando antígeno de Melcher / Diagnosis value of ELISA-IgG for human trichinosis by using Melcher's antigen

An enzyme-linked inmunosorbent assay (ELISA) for trichinosis using a Melcher's antigen was developed for the detection of IgG antibodies in 41 serum samples from patients confirmed or suspected to have trichinosis by strong clinical and epidemiological evidences. ELISA-IgG was compared with a precipitin test (PT), a bentonite floculation test (BFT) and an indirect hemagglutination test (IHAT). The cut-off value as determined using serum samples from 67 apparently healthy persons employing two serum dilutions (1:100 and 1:500) with three standard desviations (SD). The sensitivity of ELISA-IgG was 97,6 for percent and 95,2 for percent using serum dilutions of 1:100 and 1:500 respectively, whereas the values for the other tests were: PT (92,7 for percent), BFT (63,4 for percent) and IHAT (85,4 for percent). According to MacNemar test, Elisa-IgG did not present statistical significance (p>0.01). In order to find out the specificity of ELISA-IgG, additional 124 serum samples from individuals with other parasitoses, such as cysticercosis (31), fascioliasis (17), hydatidosis (51) and toxocariasis (25) were also tested. ELISA-IgG presented a specificity of 99,5 for percent with both serum dilutions. The positive predictive values were 97,6 and 97,5 for percent, whereas the negative one were 99,5 and 99,0 for percent for 1:100 and 1:500 serum dilutions respectively. The use of ELISA-IgG and Melcher's antigen in the diagnosis of human trichinosis is discussed

Renal changes in experimental trichinosis [histopathological, electron microscopic and immunofluorescent study]

The study was performed using 120 white rats [80 infected with Trichinella spiralis and 40 as a control group]. Histopathology, electron microscopy, direct and indirect immunofluorescence were carried out on the proper kidney tissue preparations weekly for 20 weeks after infection. Histopathological changes were detected in the glomeruli, tubules, and stroma of the infected animals from the 6th week after infection. Transmission electron microscopy revealed ultrastructural changes in the glomeruli and tubules, coinciding with the onset of the histopathological changes. Deposits of immunoglobulins and specific Trichinella spiralis antigens were detected in the blood vessels and glomeruli from the 8th week after infection. The results were discussed and the immunopathological mechanism of tissue damages was clarified

Serosurvey of some major zoonotic infections in children and teenagers in Bali, Indonesia.

One hundred and ninety serum samples, mainly from children and teenagers, from northeast Bali were tested for the presence of antibodies against five zoonotic agents: Brucella abortus, Coxiella burnetii, Toxoplasma gondii, Toxocara canis and Trichinella spiralis. All children were negative for brucellosis and Q fever. A high prevalence rate was found for toxocariasis (63.2%) and trichinosis (19.5%). Antibody prevalence against T. gondii was found to be rather low (3.1%). To our knowledge, this is the first evidence of toxoplasmosis, toxocariasis and trichinosis infection in humans on Bali. Eating habits and poor hygiene may explain the frequency of parasitic infestations in the children and teenagers in Bali.

Carditis in experimental trichinosis

Eighty white rats were infected with 1000 larvae of Trichinella spiralis/rat. Serum samples and the hearts of infected animals were taken weekly for 20 weeks after infection. Tissues from the heart were stained with hematoxylin and eosin and Mallory stains to demonstrate histopathological changes and with peroxidase anti- peroxidase for the detection of specific antigen deposition. Early in the disease, myocardial changes were detected. Later on, pericarditis and interstitial myocarditis were found followed by patchy myocardial necrosis and fibrosis. Antigen deposition was demonstrated mainly on sarcolemmal sheath of myocardial muscle fibers and in endothelial cell lining of blood vessels. No larvae were found in heart sections throughout the study. The pathological changes were mainly attributed to the antigen deposition and subsequent immune reaction