Inmunoensayo multiplex para el diagnóstico simultáneo de diabetes mellitus autoinmune y enfermedad celíaca / Multiplex immunoassay for simultaneous diagnostic of autoimmune diabetes mellitus and celiac disease

Introducción: la diabetes mellitus autoinmune (DMA) y la enfermedad celíaca (EC) son enfermedades crónicas, poligénicas y multifactoriales vinculadas con la disfunción del sistema inmune. Dado que es frecuente que un mismo paciente presente ambas patologías, la detección simultánea de los marcadores de autoinmunidad de DMA y EC sería una estrategia racional para mejorar el diagnóstico. Objetivos: desarrollar un inmunoensayo basado en citometría de flujo (FloCMIA multiplex) para la detección simultánea y discriminativa de marcadores de DMA (GADA e IA-2A) y de EC (tTgA). Materiales y métodos: las muestras analizadas consistieron en sueros provenientes de 35 individuos controles normales y 21 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Se empleó un modelo de "doble paratope" incubando los sueros con una mezcla de microesferas de diferente fluorescencia interna, cada una adsorbida con un autoantígeno: TrxGAD, TrxIA-2 o H6-tTg, y una mezcla de dichos autoantígenos biotinilados. Los inmunocomplejos se detectaron con estreptavidina-ficoeritrina y se adquirió en un citómetro de flujo. Resultados: FloCMIA multiplex detectó GADA en el 76,2% de los pacientes e IA-2A en el 52,38% (sensibilidad analítica: 88,24 y 56,25% respectivamente,y especificidad: 85,71%) y tTgA en el 42,86% (sensibilidad analítica: 50,0%, y especificidad: 80,0%). Estos resultados se contrastaron con el ensayo de unión de radioligando para GADA e IA-2A y se detectaron 80,95 y 76,19% de los sueros respectivamente (especificidad: 100%), y con un ELISA para tTgA se detectó un 38,1% (especificidad: 97,1%). Conclusiones: FloCMIA multiplex permitió detectar y discriminar GADA, IA-2A y/o tTgA, -en un único acto analítico- en sueros de pacientes con DMA y/o EC. El novedoso inmunoensayo desarrollado simplifica el screening de la población a gran escala

Introduction: autoimmune diabetes mellitus (ADM) and celiac disease (CD) are chronic, polygenic and multifactorial diseases associated with immune system dysfunction. As it is frequent that a patient presents both pathologies, the simultaneous detection of autoimmunity markers of ADM and CD would be a rational strategy to improve the diagnosis. Objectives: to develop an immunoassay based on Flow Cytometry (FloCMIA multiplex) for the simultaneous and discriminative detection of markers for ADM (GADA and IA-2A) and CD (tTgA). Materials and methods: thirty five serum samples of control individuals and 21 type 1 diabetes mellitus (T1DM) patients were assayed. A "double bridge" model was used for the assay, incubating the serum samples with a mixture of microspheres containing different amount of internal fluorescence, each one adsorbed with an autoantigen: TrxGAD, TrxIA-2 or H6-tTg, and a mixture of the same biotinilated autoantigens. The immunocomplexes were detected using streptavidinphycoerytrin and then acquired in a flow cytometer. Results: FloCMIA multiplex detected GADA in 76.2% of the patients; IA-2A in 52.38% (analytical sensitivity: 88.24% and 56.25% respectively, and specificity: 85.71%) and tTgA in 42.86% (analytical sensitivity: 50.0%, and specificity: 80.0%). These results were compared with the radioligand binding assay for GADA and IA-2A, detecting 80.95% and 76.19% of the serum samples respectively (100% specificity), and with an ELISA for tTgA detecting 38.1% (97.1% specificity). Conclusions: FloCMIA multiplex allowed detecting and discriminating GADA, IA-2A and/or tTgA, -in a single assay- in serum samples of ADM and/or CD. The novel developed immunoassay simplifies the screening of the large scale population

Detección y caracterización de autoanticuerpos anti-ZnT8 en pacientes argentinos con diabetes mellitus tipo 1 / Detection and characterisation of zinc transporter 8 autoantibody in Argentinian patients with type 1 diabetes mellitus

Introducción y objetivos: El transportador de Zn8 (ZnT8), identificado como el cuarto autoantígeno inmunodominante en la diabetes mellitus (DM) tipo 1, presenta un polimorfismo en el residuo 325 (Arg/Trp). Sin embargo, aún no se encuentra suficientemente definido el papel de este residuo en la inmunorreactividad de los autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A). En este contexto, el objetivo del presente trabajo involucró la detección y caracterización inmuno-química de los ZnT8A en DM tipo 1 empleando diferentes variantes antigénicas de ZnT8 con Arg o Trp en la posición 325, o bien construcciones quiméricas con ambos aminoácidos en dicha posición. Materiales y métodos: Se evaluaron 100 sueros de pacientes argentinos con reciente diagnóstico de DM tipo 1. La determinación de ZnT8A se realizó mediante el ensayo de unión de radioligando, utilizando distintas variantes antigénicas: ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8- Arg-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325. Paralelamente se determinó la presencia de los otros marcadores de autoinmunidad para DM por ensayo de unión de radioligando. Resultados: De los 100 pacientes estudiados, 65 fueron ZnT8A+ para al menos alguna de las variantes antigénicas empleadas. Ocho reconocieron todas las formas recombinantes de ZnT8. La mayoría (56) resultaron positivos para el heterodímero (ZnT8-Arg-Trp325), 25 de los cuales reconocieron además el homodímero ZnT8-Arg-Arg325 y el monómero ZnT8-Arg325. Nueve pacientes presentaron únicamente ZnT8A como marcador de autoinmunidad. Por otro lado, los niveles de señales obtenidos con el heterodímero fueron significativamente mayores a los niveles alcanzados empleando cualquiera de las otras variantes antigénicas (mediana 17,99 vs. 10,71; 6,32; 5,66 y 4,44 SD scores para ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325, respectivamente; p < 0,05, test t de Mann-Whitney). Conclusiones: Se logró caracterizar inmunoquímicamente los ZnT8A presentes en pacientes argentinos con DM tipo 1 empleando diferentes variantes antigénicas de ZnT8. Se observó que la incorporación de ZnT8A, en combinación con los marcadores clásicos, incrementa la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad. La reactividad exclusiva de ZnT8A por las variantes antigénicas que contienen arginina en el residuo 325 evidencia la existencia de epítopes dependientes del aminoácido presente en dicho residuo. Además, la aplicación de variantes diméricas reveló la existencia de epítopes definidos por la estructura cuaternaria de ZnT8. La construcción heterodimérica fue la que mostró la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario de ZnT8A.

Introduction and objectives: The aim of this study involved the detection and immunochemical characterisation of ZnT8 autoantibodies (ZnT8A) in new-onset type 1 Argentinian diabetic patients. Material and methods: One hundred sera from type 1 diabetic patients were tested for ZnT8A. The antigens employed were obtained using cDNA plasmids encoding the C-terminal domains of ZnT8 carrying 325Arg, 325Trp and 3 dimeric constructs (ZnT8-Arg-Trp325, ZnT8- Arg-Arg325 and ZnT8-Trp-Trp325). ZnT8A were assessed by radioligand binding assay (RBA). Other islet-autoantibodies were also tested by RBA. Results: Among the 100 type 1 diabetic patients, the prevalence of ZnT8A was 65.0%, 8 recognized all recombinant forms of ZnT8. Most patients (56) were positive for the heterodimer (ZnT8-Arg-Trp325), being 25 of them also positive for the homodimer ZnT8-Arg-Arg325 and monomer ZnT8-Arg325. Single reactivity against ZnT8A was found in 9.0% of the group. Besides, the highest signal values were obtained with the heterodimeric variant (median 17.99 vs. 10.71, 6.32, 5.66 and 4.44 SD scores for ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325, respectively; p < 0.05, Mann-Whitney t test). Conclusion: Immunochemical characterisation of ZnT8A present in type 1 Argentinian diabetic patients was accomplished, employing different variants of ZnT8. An increased detection of autoimmunity was found when ZnT8A was employed in combination with the other islet-autoantibodies. The presence of autoantibodies that recognized only constructions containing Arg reveals the existence of epitopes dependent of the amino acid present at residue 325. Furthermore, application of dimeric constructions revealed the existence of quaternary structure-defined epitopes which were recognized by type 1 diabetic patients. Finally, the highest combined sensitivity and specificity for routine screening of ZnT8A was accomplished with the heterodimeric construction.

Frequency Of Pancreatic Beta-Cell Autoimmunity Markers In Patients With Autoimmune Thyroid Disease / Frecuencia de marcadores de autoinmunidad beta pancreática en pacientes con enfermedad tiroidea autoinmune

A total of 305 ambulatory patients recruited at the Division of Endocrinology, Hospital de Clínicas, University of Buenos Aires, with autoimmune thyroid disease (AITD) were studied to search for associations between autoimmune thyroid disease and presence of serum markers of autoimmune diabetes mellitus. Screening for markers of pancreatic beta-cell autoimmunity was performed by radioligand binding assays (RBA) as follows: autoantibodies to glutamic acid decarboxylase (GADA) and proinsulin (PAA) were determined in all sera, whereas autoantibodies to protein tyrosine phosphatase (IA-2A) and insulin (IAA) were additionally measured in 200 sera randomly selected from the total collection. In addition, every GADA positive serum among the remaining 105 sera was systematically tested for the presence of IA-2A and IAA. In the cohort of 305 AITD patients 22 (7.2%) were previously diagnosed as type 1, type 2 or insulin-requiring type 2 diabetics. Ten of these patients presented serum marker positivity specific for β-cell autoantigens and 12 were marker negative. On the other hand, considering the majority of non-diabetic AITD patients (n=283), β-cell marker positivity was detected in 17 individuals (6.0%). The prevalence of autoimmune diabetes markers was much higher in the studied population than in the general population utilized as a control group, and GADA was the most frequent marker.

Se investigó la asociación entre enfermedad tiroidea autoinmune y la presencia de marcadores séricos de diabetes mellitus en 305 pacientes ambulatorios con enfermedad tiroidea autoinmune reclutados en la División Endocrinología. La búsqueda de marcadores de autoinmunidad contra las células beta pancreáticas se realizó por la técnica de unión de radioligandos (RBA) como se detalla a continuación: se determinaron autoanticuerpos contra la decarboxilasa del ácido glutámico (GADA) y proinsulina (PAA) en todos los sueros, mientras que los anticuerpos contra la proteína tirosina fosfatasa (IA-2A) e insulina (IAA) fueron medidos en 200 de estos sueros tomados al azar de la colección total. Además, en los restantes 105 pacientes, la presencia de IA-2A y IAA fue evaluada en todos los sueros positivos para GADA. Del grupo de 305 pacientes con enfermedad tiroidea autoinmune 22 (7.2%) fueron diagnosticados previamente como diabéticos tipo 1, tipo 2 o tipo 2 insulino-requirientes. Diez de ellos presentaron positividad para marcadores específicos de autoantígenos de célula β, en tanto 12 fueron negativos. Por otra parte, en 17 de los 283 pacientes (6.0%) con enfermedad tiroidea autoimmune y sin diagnóstico previo de diabetes, se detectó positividad para marcadores de célula β. La prevalencia de marcadores de autoinmunidad asociados a diabetes fue mayor en la población estudiada que en la población general usada como grupo control, siendo GADA el marcador más frecuente.

Variantes de la diabetes mellitus: enfoque actual desde la genética y la biología molecular / Variant of the diabetes mellitus: current approach from the genetics and the molecular biology

La Diabetes Mellitus (DM), de acuerdo a la definición clásica, es una enfermedad metabólica caracterizada por la hiperglucemia. Esta a su vez resulta de un defecto en la secreción de insulina, en su acción, o en ambos factores a la vez. Por ello tempranamente se consideró a la DM como heterogénea y de origen multifactorial. Las dos formas típicas son la DM insulinodependiente, infantojuvenil, (DM tipo 1) y la DM no-insulinodependiente, diagnosticada en los adultos (DM tipo 2).Sin embargo, hoy se percibe un panorama mucho más complejo, donde los refinamientos en la subagrupación fenotípica de otras variantes de DM y la nomenclatura propuesta, (DM latente, o LADA, DM tipo 1 del adulto, DM tipo 2 insulinorrequiriente, DM tipo 1 y 1/2 etc.) condujo más a la confusión que a la precisión diagnóstica. Los avances contemporáneos de la genética y de la biología molecular comienzan a brindar las bases etiopatogénicas de la DM en sus distintas variantes. A partir de ello, por ejemplo, se puede comprender mejor la naturaleza de los condicionamientos multigénicos que se traducen en la susceptibilidad para padecer la DM tipo 1, dentro de un grupo mayor de enfermedades autoinmunes. En esta área el reciente desarrollo de los autoantígenos recombinantes a nivel internacional, e incluso local, ha contribuído sustancialmente a la creación de una nueva plataforma analítica de apoyo para la medicina dibetológica. El actual screening precoz y preciso de las formas de DM asociadas a autoinmunidad sirve para la predicción de la enfermedad con hasta una década de antelación y también para disipar algunos de los dilemas que suelen presentarse en los pacientes diabéticos sobre la intervención terapéutica con hipoglucemiantes orales o con insulina, orientando su elección correcta y oportuna.

Obtención de 35 S-proinsulina humana recombinante y su aplicación en un ensayo radiométrico combinado: Utilidad del método desarrollado para predecir el requerimiento de insulina en pacientes diabéticos adultos / Obtaining of 35 recombinant human S-proinsulina and its application in a combined radiometric test: Utility of the developed method to predict the insulin requirement in adult diabetic patients

Los autoanticuerpos anti glutamano decarboxilasa y anti insulina/proinsulina(GADA e IAA/PAA)tienen valor predictivo del requerimiento insulínico en pacientes diabéticos con comienzo clínico en edad adulta. En este trabajo se desarrolló un nuevo trazador 35 S-Proinsulina y se lo utilizó en un ensayo de unión de radioligando combinado con el trazador 35 S-GAD para la determinación simultñanea de GADA y PAA (RBA-combi). Se aplico el ensayo a 85 pacientes infanto-juveniles con diabetes tipo 1, a 98 pacientes con comienzo clínico en edad adulta y a 53 controles normales. El 100% de los pacientes con diabetes tipo 1 con al menos un marcador positivo, y el 17,7% de los que eran negativos para ambos marcadores, fueron positivos por el RBA-combi(RBA-comi+). El 100% de los pacientes adultos PAA+(GADA+ o GADA-) el 92,3% de los pacientes GADA+/PAA-, y el 1,3% de los pacientes GADA-/PAA-, fueron RBA-combi+. El 88.9% de los pacientes adultos RBA-combi+evolucionaron a requerimiento insulínico. En conclusión, el nuevo trazador 35 S-Proinsulina fue apto para su utilización en el método radiométrico combinado, permitiendo la detección simultánea de los marcadores GADA Y PAA. El RBA- combi es una herramienta valiosa para detectar procesos autoinmunes asociados a un futuro requerimiento insulínico, en pacientes diabéticos adultos.

Marcadores inmunológicos y genéticos en diabetes mellitus tipo 1 en Argentina / Immunologic and genetic markers in type 1 diabetes mellitus in Argentina

El objetivo del trabajo fue evaluar la prevalencia y asociación de los marcadores inmunológicos (anticuerpo anti-islote pancreático: ICA, autoanticuerpo anti-insulina: IAA, anticuerpo antidecarboxilasa del ácido glutámico: GADA y anticuerpo anti ICA512) y con el genotipo HLA DQBl en pacientes con diabetes tipo 1 de reciente debut, hermanos de diabéticos y personas sin historia de enfermedad autoinmune en población argentina. Se estudiaron 79 niños con diabetes tipo 1 de reciente debut, 79 niños controles y 68 hermanos sanos de niños con diabetes 1. En todos ellos se determinó IAA, GADA, ICA, ICA512 y alelos HLA DQB1. La sensibilidad para ICA fue de 67.1 por ciento; para IAA de 36,7 por ciento; para GADA de 74,6 por ciento, y para ICA512 de 63,4 por ciento. Ninguno de los niños control presentó marcadores inmunológicos positivos. La sensibilidad combinada de ICA-IAA-GADA fue de 89,8 por ciento, similar a la de ICA512-GADA (87.3 por ciento) o la combinación de ICA512-GADA-IAA (91.1 por ciento). El valor de GADA presentó correlación positiva con el de ICA, no encontrándose correlación alguna entre los valores de IAA, ICA512 e ICA. El valor de IAA presentó correlación negativa y el de GADA positiva con la edad de los pacientes. La presencia de IAA se asoció con DQB1 *0201, mientras que la de ICA e ICA512 con DQB1 *0302. Entre los hermanos, 3/68 (4,4 por ciento) fueron positivos para IAA, uno (1,5 por ciento) lo fue para GADA y otro (1.5 por ciento) para ICA512. Nuestros resultados muestran que la combinación de múltiples marcadores incrementa la sensibilidad predictiva, siendo la asociación ICA512-GADA altamente sensible y equivalente a otras combinaciones propuestas como ICA-IAA-GADA

Immunologic and genetic markers in insulin-dependent diabetes mellitus (Type 1) in a argentine population

The objective was to evaluate the prevalence and association of several markers (islet cell antibodies: ICA, ainsulin autoantibodies: IAA, glutamic acid decarboxylase antibodies: GADA and ICA512 antibodies: ICA512A) along with HLA DQB1 genotype in type 1 diabetes mellitus of recent onset, including siblings and individuals without any history of this disease, in an Argentine population. A total of 79 children with type 1 diabetes mellitus of recent onset were studied, as well as 79 control children, and 68 healthy siblings of type 1 diabetic cases. IAA, ICA, GADA, ICA512A and HLA DQB1 alleles were determined. Sensitivity was 67.1 por ciento for ICA, 36.7 percent for IAA, 74.6 por ciento for GADA and 63.4 por ciento ICA512A. None of the control subjects was positive for the immunological markers. Combined sensitivity of ICA-IAA-GADA was 89.8 por ciento, similar to the ICA512A- GADA (87.3 percent) or ICA512A-GADA-IAA combination (91.1 por ciento ). GADA correlated positively with ICA, but no such correlation was found between IAA, ICA512A and ICA. IAA correlated negatively and GADA positively with age. IAA was associated to DQB1*0201, whereas ICA and ICA512A associated to DQB1*0302. Among siblings, 3/68 (4.4 percent) were positive for IAA and a single case (1.5 percent) was positive for GADA and one for ICA512A. Our findings show that the combination of multiple tests increases the sensitivity for prediction, with the ICA512A-GADA combination proving highly sensitive and equivalent to other proposed combinations, such as ICA-IAA-GADA.