Two novel heterozygous missense variations within the GLI2 gene in two unrelated argentine patients / Two novel heterozygous missense variations within the GLI2 gene in two unrelated Argentine patients

Several heterozygous GLI2 gene mutations have been reported in patients with isolated GH deficiency (IGHD) or multiple pituitary hormone deficiency (MPHD) with or without other malformations. The primary aim of this study was to analyze the presence of GLI2 gene alterations in a cohort of patients with IGHD or MPHD and ectopic/absent posterior pituitary. The coding sequence and flanking intronic regions of GLI2 gene were amplified and directly sequenced from gDNA of 18 affected subjects and relatives. In silico tools were applied to identify the functional impact of newly found variants (Polyphen2, SIFT, Mutation Taster). We identified two novel heterozygous missense variations in two unrelated patients, p.Arg231Gln and p.Arg226Leu, located in the repressor domain of the protein. Both variations affect highly conserved amino acids of the Gli2 protein and were not found in the available databases. In silico tools suggest that these variations might be disease causing. Our study suggests that the GLI2 gene may be one of the candidate genes to analyze when an association of pituitary hormone deficiency and developmental defects in posterior pituitary gland. The highly variable phenotype found suggests the presence of additional unknown factors that could contribute to the phenotype observed in these patients.

Mutaciones heterocigotas en el gen GLI2 fueron previamente comunicadas como causa de déficit aislado de hormona de crecimiento (IGHD) o déficit múltiple de hormonas hipofisarias (MPHD), con o sin otras malformaciones. El objetivo del estudio fue analizar la presencia de alteraciones en el gen GLI2 en un grupo de pacientes con IGHD o MPHD acompañado de neurohipófisis ectópica o ausente. La secuencia codificante y las regiones intrónicas flanqueantes del gen GLI2 fueron amplificadas y secuenciadas de manera directa a partir de ADN genómico extraído de sangre periférica proveniente de 18 sujetos afectados y sus familiares. Se utilizaron herramientas informáticas para predecir el impacto funcional de las nuevas variantes encontradas (Polyphen2, SIFT, Mutation Taster). Identificamos dos nuevas variantes heterocigotas con pérdida de sentido en dos pacientes no relacionados, p.Arg231Gln y p.Arg226Leu, localizadas en el dominio represor de la proteína. Estas variantes afectan aminoácidos altamente conservados en la secuencia proteica de GLI2 y no se encuentran informadas en las bases de datos disponibles. Las herramientas informáticas utilizadas sugieren que estas variantes pueden ser la causa del desarrollo de la enfermedad. Nuestro resultados indican que el gen GLI2 es uno de los genes candidatos a estudiar cuando existe una asociación entre déficit de hormonas hipofisarias y alteraciones en el desarrollo de la neurohipófisis. Se sugiere la existencia de otros factores adicionales que podrían contribuir a la variabilidad del fenotipo observado.

Nueva mutación heterocigota en el gen de la proteína regulatoria aguda de la esteroideogénesis (StAR) en un paciente 46,XY con hiperplasia adrenal congénita lipoidea / [Novel heterozygous mutation in the steroidogenic acute regulatory protein gene in a 46,XY patient with congenital lipoid adrenal hyperplasia].

StAR facilitates cholesterol entry into the mitochondria as part of the transduceosome complex. Recessive mutations in the gen STAR cause classic and nonclassic congenital lipoid adrenal hyperplasia. The aim of the study was to analyze the molecular consequences of a novel heterozygous STAR mutation in a 46,XY patient with ambiguous genitalia and adrenal insufficiency. We found a de novo heterozygous IVS-2A>G STAR mutation and the reported heterozygous p.G146A SF1 polymorphism with normal CYP11A1, FDXR, FDX1, VDAC1 and TSPO genes. RT-PCR and sequencing from patient’s testicular RNA showed a -exon2 transcript and the wild-type (WT) transcript. Both 37 kDa precursor and 30 kDa mature protein were detected in COS-7 cell transfected with mutant and WT plasmids. Immunofluorescence showed almost no co-localization of mitochondria and mutant protein (delta22-59StAR). Delta22-59StAR activity was 65±13

of WT. Cotransfection with WT and delta22-59StAR plasmids reduced WT activity by 62.0

± 13.9. Novel splice-junction heterozygous STAR mutation (IVS-2A>G) resulted in the in-frame loss of amino acids 22 to 59 in the N-terminal mitochondrial targeting signal. A misfolded p.G22_L59delStAR might interfere with WT StAR activity by blocking the transduceosome complex, causing an autosomal dominant form of StAR deficiency, explaining the clinical phenotype.

El splicing alternativo del exón 5 de la citocromo p450 aromatasa podría ser un mecanismo de regulación de la producción de estrógenos en humanos / Exon 5 alternative splicing of the cytochrome P450 aromatase could be a regulatory mechanism for estrogen production in humans

La enzima P450 aromatasa (P450Aro) participa en la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. La mutación c655G>A, descripta en forma heterocigota en una niña y en forma homocigota en un hombre adulto, ambos con déficit de aromatasa, genera la disrupción del sitio dador de splicing exón5-intrón5. Se ha postulado que la retención del intrón5 y la generación de una proteína truncada inactiva serían las consecuencias de esta mutación. Sorpresivamente, la paciente presentó desarrollo espontáneo de mamas y niveles puberales de estradiol, sugiriendo una actividad aromatasa (AA) residual. En principio postulamos que la mutación c655G>A generaría la pérdida del exón5 con conservación del marco de lectura, generándose una proteína con menor actividad que podría explicar el déficit parcial. La expresión del ARNm sin exón5 (ARNm- E5) en linfocitos de la paciente sugiere una asociación entre la pérdida del exón y la presencia de la mutación; posteriormente confirmada realizando ensayos de splicing en células Y1. Sin embargo, la expresión del cDNAE5 en células Y1 presentó una AA nula que no explicaría un déficit parcial. La expresión del ARNm-E5 fue detectada en placenta, testículo y adrenal humanos como una variante de splicing normal. Estos resultados indicarían la ocurrencia de splicing alternativo (SA) en la zona codificante de P450Aro como un posible mecanismo regulador de la producción de estrógenos en tejidos esteroidogénicos humanos. La mutación c655G>A podría alterar los mecanismos fisiológicos reguladores del SA del exón5 favoreciendo su exclusión. De esta forma, bajos niveles de ARNm+E5 podrían expresarse aun en presencia de la mutación explicando el fenotipo de déficit parcial observado en la paciente.

P450 aromatase (P450Aro), involved in androgen to estrogen conversion, is encoded by the CYP19 gene. P450Aro c655G>A mutation described in heterozygous form in a girl and in homozygous form in an adult male with P450Aro deficiency results in an aberrant splicing due to disruption of a donor splice site. A truncated inactive protein would be expected if intron5 is retained. Surprisingly, the girl described with this mutation showed spontaneous breast development and pubertal estradiol (E2) levels suggesting residual P450Aro activity (AA). Formerly, we postulate the in frame E5 skipping as a consequence of this mutation generating a protein with some degree of activity. When P450Aro mRNA expression was analysed from patient's lymphocytes, an aberrant spliced mRNA lacking E5 (-E5mRNA) was detected, suggesting an association between E5 skipping and the presence of the mutation. Splicing assays in Y1 cells confirmed this association. -Ex5 cDNA expression in Y1 cells resulted in an inactive protein that could not explain patient's phenotype. Exon 5 might be predicted as a poorly defined exon suggesting a susceptibility to splicing mutations and physiological alternative splicing (AS) events. Therefore, -Ex5mRNA was assessed as a natural occurring alternative transcript in normal human steroidogenic tissues. As P450Aro -E5mRNA expression was detected in human term placenta, prepubertal testis and prepubertal adrenal, we might speculate that AS of P450Aro coding region would occur in humans and would be involved in the complex AA regulation. Furthermore, tissue specific regulation of AS might suggest low expression of +E5mRNA from the c655G>A allele explaining residual AA evidenced in the affected girl.

Effect of the dose of oral hydrocortisone on growth rate during long-term treatment of children with salt losing congenital adrenal hyperplasia

The effect of the dose of oral hydrocortisone on stature growth rate of patients with the salt losing form of congenital adrenal hyperplasia and adequate electrolyte balance was here assessed. Thirty patients (21 girls and 9 boys) were followed longitudinally for 0.52 to 8.64 years, between chronological ages 0.35 and 8.64 years. Nine consecutive periods (Ps) of follow up were defined in order to compare two auxological parameters, height (H) at the end of a follow up P and DH standard deviation score (SDS). According to growth rate during a particular P, two types of Ps were defined: Ps with DH SDS > -0.5 (Group 1, satisfactory growth rate) and Ps with DH SDS = or < -0.5 (Group 2, poor growth rate). A cut off value of 18.5 mg/m 2 /day of oral hydrocortisone (95% CI upper limit of group 1) was defined to separate acceptable from excessive doses. In P2, mean (± SD) H SDS (-1.81 ± 1.15) was significantly lower than in any of the other Ps (p < 0.001). In P1 and in P2, DH SDS was negative, but it was positive in P3 and in P4. Hydrocortisone dose in P1 and in P2 was significantly higher than in the rest of the Ps. All patients in P1 and most patients in P2 , but not in other Ps, received excessive doses. Predicted adult H, calculated in 9 patients was not statistically different from their respective target H. It is concluded that,during the first year of life, our patients received an excess of oral hydrocortisone (> 18 mg/m 2 /day) and grew poorly, but they were able to recover, at least temporarily, when the dose was adjusted during the following years

Analisis molecular de las mutaciones más frecuentes asociadas a la hiperplasia suprarrenal congenita por deficit de la enzima 21 hidroxilasa / Molecular analysis of the most frequent mutations associated with congenital adrenal hyperplasia secondary to 21-hydroxylase enzyme deficiency

El 90 porciento de los casos de HSC se deben al déficit de la enzima P450c21. En el humano ha sido descripto un gen activo que codifica para la enzima 21 hidroxilasa, el CYP21B, y un gen no funcional denominado CYP21A. Estos genes, ubicados en el brazo corto del cromosoma 6, presentan una hemología entre sí del 98 porciento. La alta homología entre los genes CYP21 y la complejidad de este locus génico, dificulta su análisis a nível molecular y la interpretación de los resultados obtenidos. El objetivo del presente estudio fue elaborar una estrategia adecuada para la caracterización de las alteraciones más frecuentes descripta del gen CYP21B. Se analizaron 77 individuos con diagnóstico clínico y bioquímico de HSC por déficit de la enzima P450c21, pertenecientes a 73 familias no relacionadas (146 cromosomas). La estrategia elaborada permitió diferenciar pacientes con mutaciones puntuales (MP) homocigotas, pacientes con MP en un alelo y deleciones o conversiones en el otro, o pacientes con MP en un alelo y las MP Ex3 o Cluster Ex6 en el otro, aun cuando los progenitores del paciente no estuvieran disponibles para el estudio. Por otro lado, permitió discriminar deleciones o conversiones heterocigoticas de duplicaciones del gen no funcional CYP21A, así como deleciones de los genes CYP21A y B, de un número de copias normales de estos genes. Un análisis exhaustivo del conjunto de los resultados obtenidos en el análisis molecular de este gen resulta indispensable para efectuar una caracterización adecuada de las alteraciones presentes en este locus.

La investigación científica en un hospital de alta complejidad / Scientific research in a tertiary hospital

Dado que el rol primario de un hospital es prestar un servicio asistencial, la investigación científica que se desarrolla en el mismo suele estar fuertemente influenciada por la asistencia. Este hecho, a la vez, condiciona y motoriza a la tarea de investigación, limitándola pero facilitando su transferencia al medio. Es decir, la investigación en los hospitales suele ser mayoritariamente clínica e interacciona con la asistencia y la docencia a nivel de recursos, gestión, programas de acción y proyectos específicos

Variations in soluble and particulate ABP of rat testis during sexual development

La proteína ligadora de andrógenos (ABP) fue determinada en las fracciones citosólica (cABP) y particulada (pABP), obtenidas por centrifugación diferencial de homogenatos testiculares de ratas. Se prepararon homogenatos en condiciones de estabilización para el ABP por el agregado de testosterona 350 nM al "buffer" de homogeneización. Se observó que tanto los niveles por mg/prot de cABP como de pABP eran máximos entre los 22 y 32 días de edad de la rata, disminuyendo a partir de allí durante la maduración sexual. Cuando los resultados se expresaron por órgano, ambas proteínas aumentaron con la edad del animal. La pABP pudo ser solubilizada en condiciones en que mantuvo su capacidad de unión a andrógenos, procediéndose entonces a su fotomarcación y posterior cromatografía en una columna de Sephadex G-0200, usando el ABP de citosol de epidídimo como control. Se observó que el ABP no sólo comparte con el cABP las mismas características físico-químicas para la unión de andrógenos, sino también el volumen de exclusión en la cromatografía mencionada. Dado que la pABP está solamente presente en la célula de Sertoli, probablemente represente ABP antes de ser secretado. Su localización subcelular sugiere un posible papel del ABP en la distribución de andrógenos testiculares

Photoaffinity labeling of extracellular and intracellular androgen binding proteins

Se describe un método de marcación por fotoafinidad de la SHBG sérica humana y de conejo en un precipitado de sulfato de amonio utilizando delta6-testosterona 3H como ligando. La precipitación disminuye la contaminación con albúmina y concentra al mismo tiempo la globulina ligadora de hormonas sexuales. La marcación por fotoafinidad se realizó mediante un flash electrónico. El esteroide libre y el no unido covalentemente se adsorbieron mediante un tratamiento prolongado con una solución de carbón dextrán. La cromatografía en columna de Sephadex G-200 mostró un único pico radioactivo unido covalentemente con el volumen de elución de la SHBG. Este preparado es útil para ser utilizado en estudios de metabolización de la SHBG in vivo. Con algunas modificaciones, el método fue aplicado a la marcación por fotoafinidad del receptor citosólico de andrógenos de próstata utilizando al R 1881 como ligando. El receptor de andrógenos de citosol de próstata también fue precipitado con sulfato de amonio. Luego de marca, irradiar y calentar a 50- C el R 1881-3H no unido covalentemente fue removido mediante el tratamiento con carbón dextrán. En presencia de fotólisis previa al tratamiento con calor, la cromatografía en microcolumnas de Sephadex G-25 mostró un pico radiactivo que eluyó con el volumen de elución de las macromoléculas, el cual desaparecía en las muestras no fotolizadas previamente; sin embargo el receptor fotomarcado tuvo un coeficiente de sedimentación, luego de ultracentrifugación en gradientes lineares de sucrosa, diferente del receptor no irradiado, sugiriendo que la fotólisis generó a algún cambio en la configuración del complejo

Acute effect of hOG on testicular and epididymal levels of androgen binding protein (ABP) in the immature rat

Se estudió en ratas inmaduras el efecto agudo de la hOG y la testosterona sobre los niveles testiculares (fracciones particulada y soluble) y epididimarios (fracción soluble) de la proteína ligadora de andrógenos (ABP). La administración de una única inyección de hOG (10 UI/rata) produjo una leve disminución de la proteína ligadora de andrógenos (ABP) en el testículo (fracciones particulada y soluble). Este efecto fue observado una y cuatro horas después del tratamiento. Simultáneamente se observó un aumento significativo en la concentración de ABP en el epidídimo (1 h: 169 ñ 5; 4 h: 182 + 5vs. control: 113 ñ13 fmol/mg proteína, media ñ ESM). El aumento en la concentración de testosterona en testículo y epidídimo sugeriría que el efecto observado podría estar mediado por la estimulación gonadatrófica de la síntese de andrógenos en la célula de Leydig. Para comprobar esta hipótesis, el efecto de la hOC se estudió en ratas tratadas previamente con aminoglutetimida para bloquear la esteroidogénesis. En este modelo experimental no se observó un aumento en la concentración de ABP epididimario por la acción de la gonadotrofina. finalmente, la administración de propionato de testosterona indujo un incremento en la concentración de ABP epididimario 4 h después del tratamiento (212 + 18vs. 127 ñ 28 fmol/mg proteína, media ñ ESM). Los resultados obtenidos sugieren que la elevación de los androgénos testiculares inducida por hOG produce un pasaje rápido de ABP desde el testículo hacia el epidídimo

Detección temprana de hipotiroidismo congénito en una población de recién nacidos de riesgo / Early detection of congenital hypothyroidism in a population of high risk newborn

El beneficio de um diagnóstico y tratamiento precoces del hipotiroidismo congénito (HC) en el desarrollo mental ha llevado, en numerosos países, a implementar programas de detección en recién nacidos. Dadas las dificultades de su realización en nuestro medio, hemos desarrollado como alternativa la detección en una población preseleccionada de recién nacidos de riesgo. Determinamos radioinmunológicamente la tirotrofina (TSH) en gotas de sangre recolectadas a partir del 3er día de vida en papel de filtro en recién nacidos provenientes de 6 maternidades de Capital Federal y Gran Buenos Aires, en los que se distribuyeron formularios para realizar la selección sobre la base de signos precoces de HC. El programa fue planeado para el período neonatal; sin embargo recibimos muestras de niños de hasta 1 año de edad. Entre el 1§ de enero de 1979 y el 31 de octubre de 1984 se detectaron 72 hipotiroideos congénitos en 2.508 muestras estudiadas. La distribución por edades de las muestras y de los hipotiroideos detectados fue la siguiente: grupo I (3-30 d) 1.575 con 17 hipotiroideos; grupo II (31-60 d) 468 con 16 hipotiroideos; grupo IV (61d-6m) 311 con 27 hipotiroideos y grupo IV (> 6-12 m) 154 con 12 hipotiroideos. Los signos más frecuentes que determinaron el estudio en el período neonatal fueron: ictericia prolongada (77%), hernia umbilical y/o caída tardía del cordón (65%) y constipación (41%). Este programa constituve la mejor segunda alternativa frente a la pesquisa masiva y contribuye a disminuir la edad de diagnóstico del HC en nuestro medio y a crear la conciencia en el pediatra y en los padres de la importancia de la detección y tratamiento precoces del HC en estos niños que, de otro modo, desarrollarán daño mental irreversible