RESUMEN
BACKGROUND The Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccine comprises a family of strains with variable protective efficacy against pulmonary tuberculosis (TB) and leprosy, partly due to genetic differences between strains. OBJECTIVES Previous data highlighting differences between the genomes and proteomic profiles of BCG strains Moreau and Pasteur led us to evaluate their behaviour in the macrophage microenvironment, capable of stimulating molecular responses that can impact the protective effect of the vaccine. METHODS Strain infectivity, viability, co-localisation with acidified vesicles, macrophage secretion of IL-1 and MCP-1 and lipid droplet biogenesis were evaluated after infection. FINDINGS We found that BCG Moreau is internalised more efficiently, with significantly better intracellular survival up to 96 h p.i., whereas more BCG Pasteur bacilli were found co-localised in acidified vesicles up to 6 h p.i. IL-1β and MCP-1 secretion and lipid droplet biogenesis by infected macrophages were more prominent in response to BCG Pasteur. MAIN CONCLUSION Overall, our results show that, compared to Pasteur, BCG Moreau has increased fitness and better endurance in the harsh intracellular environment, also regulating anti-microbial responses (lower IL-1b and MCP-1). These findings contribute to the understanding of the physiology of BCG Moreau and Pasteur in response to the intraphagosomal environment in a THP-1 macrophage model.
RESUMEN
A tuberculose continua sendo uma doença relevante no que diz respeito à saúde mundial. A doença é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e a única medida profilática disponível é a vacinação com BCG, uma cepa atenuada derivada de M. bovis. BCG é uma família de diferentes cepas que possuem diferenças genéticas entre si. Pequenas mutações em sequências codificantes podem causar impactos funcionais relevantes, modificando drasticamente a função/estrutura da proteína ou até alterando o nível de expressão, devido à modificação de processos de transcrição/tradução. Para melhor compreender o impacto dessa categoria de mutação na biologia do BCG, identificamos e selecionamos casos de mutação em três loci preditos de estarem envolvidos em processos biológicos importantes para micobactérias, como metabolismo redox (dodecina rv1498A), metabolismo lipídico (homólogo de rv1371/2/3) e respiração anaeróbica (fumarato redutase). Essas mutações foram identificadas pela análise de genômica comparativa entre M. tuberculosis H37Rv e M. bovis BCG Moreau. Análises de RT-PCR e western blotting mostram que a transcrição e tradução desses genes não foram afetadas pelas mutações. Modelagem estrutural das proteínas mutadas indica um drástico impacto na atividade de dodecina, corroborado por nossos ensaios funcionais, diferentemente do complexo da fumarato redutase. Mutantes knockout foram criados e resultados preliminares mostram que o operon da fumarato redutase é funcional em BCG Moreau, já que o mutante frd possui um fenótipo diferencial no crescimento quando comparado com a cepa selvagem
Já para rv1371/2/3 não foi observado tal padrão. Complementação da cepa selvagem com alelos de rv1371/2/3 de M. tuberculosis e BCG corrobora a hipótese de não-funcionalidade da cópia de BCG, já que identificamos lipídeos diferentes quando ambas as cepas foram comparadas. Não foi viável a inativação do gene codificante para dodecina, nem a construção da cepa de knockdown condicional, que seria utilizada para analisar a essencialidade desse gene. Complementação de M. smegmatis com os alelos de rv1498A de M. tuberculosis e BCG mostram que ambas as cópias resultaram em maior crescimento das cepas em meio axênico, em uma magnitude similar para ambos os alelos em comparação com a cepa selvagem. Análises proteômicas revelam que diversos genes com pequenas mutações que possuem diferenças em seu nível de expressão quando comparadas as diferentes fases de crescimento estão envolvidos em metabolismo lipídico, revelando a importância de se investigar tal característica. Nossos resultados mostram que algumas mutações preditas podem não causar o impacto funcional esperado, provavelmente porque forças seletivas podem estar atuando sob esses loci. (AU)