Análise da viabilidade e infectividade de taquizoítas de toxoplasma gondii em condições axênicas / Viability and infectivity analysis of toxoplasma gondii underaxenic conditions

Aims: To investigate the infectivity and viability of the tachyzoite form of Toxoplasma gondii maintained in axenic medium. Methods: Tachyzoites of Toxoplasma gondii isolated from infected mice were suspended in phosphate-buffered saline pH 7.2 or phosphate-buffered saline pH 7.2 plus 10% or 20% foetal calf serum, and incubated for 24 and for 48 hours at 37ºC. Afterwards the parasites were: (i) incubated with propidium iodide and analysed by flow cytometry, using the fluorescence-activated cell sorting (FACS) system; (ii) injected in mice to check the parasite viability in axenic conditions and, (iii) added to mouse embryonic fibroblasts to investigate their infectivity and ability to intracellular development. Results: Analysis by flow cytometry showed that Toxoplasma gondii tachyzoites maintained in phosphate-buffered saline supplemented with 20% foetal calf serum displayed high cellular viability. The parasites kept their infectivity in both the in vivo and the in vitro systems, respectively demonstrated by their ability to replicate in mice and to form rosettes in mouse embryonic fibroblasts. Conclusions: Our data open new perspectives for the study of different aspects of Toxoplasma gondii cell biology, including nutrition mechanisms, in vitro drug trials, or cellular and molecular studies to be performed directly on the parasite.

Objetivos: investigar a infectividade e a viabilidade de formas taquizoítas de Toxoplasma gondii mantidas em meio axênico. Métodos: taquizoítos de Toxoplasma gondii foram isolados de camundongos infectados, ressuspensos em tampão fosfato-salino pH 7,2 ou tampão fosfato-salino pH 7,2 mais soro fetal bovino a 10% ou 20% e incubados por 24 e 48 horas a 37ºC em atmosfera contendo 5% de CO2. A seguir os parasitos foram: (i) incubados com iodeto de propídio e analisados por citometria de fluxo utilizando a técnica de separação de células ativada por fluorescência (fluorescence activated cell sorting ? FACS); (ii) injetados em camundongos para analisar a infectividade dos parasitos mantidos em condições axênicas; e (iii) adicionados à cultura de fibroblastos de embrião de camundongo para investigar a sua capacidade infectiva e multiplicativa com formação de rosetas e lise celular. Resultados: a análise por citometria de fluxo mostrou que os taquizoítos de Toxoplasma gondii mantidos em tampão fosfato-salino suplementado com 20% de soro fetal bovino apresentaram elevada viabilidade celular. Os parasitos mantiveram sua infectividade nos sistemas in vivo e in vitro, respectivamente demonstrada por sua capacidade de se replicar em camundongos e de infectar culturas de fibroblastos. Conclusões: nossos dados abrem novas perspectivas para o estudo de diferentes aspectos da biologia do Toxoplasma gondii, incluindo mecanismos de nutrição, ensaios experimentais de drogas in vitro, ou estudos da biologia celular e molecular diretamente sobre o parasito.

Conversão in vitro de taquizoítos em bradizoítos de toxoplasma gondii em células musculares esqueléticas / Conversion in vitro of tachyzoite in bradyzoite of toxoplasma gondii in skeletal muscle cells

A diferenciação no desenvolvimento é um processo fundamental em organismos vivos. É essencial em organismos multicelulares e comum entre procariotos e eucariotos unicelulares. No caso de protozoários parasitas, tal diferenciação é frequentemente um processo obrigatório que distingue estágios do ciclo de vida sendo requerido para (i) reprodução sexual, (ii) transmissão entre os hospedeiros mamíferos e vetores invertebrados, ou para (iii) sobrevivência dentro de diferentes nichos no hospedeiro. Embora seja do conhecimento que Toxoplasma gondii forma cistos preferencialmente no cérebro e na musculatura esquelética, pouca atenção tem sido dada às células musculares esqueléticas como um tipo celular para estudo da estágio-conversão do parasito. A persistência na musculatura esquelética é crítica para a sua transmissão para humanos através da ingestão de carne crua ou mal passada. na presente tese, culturas primárias de células musculares esqueléticas (CME) foram altamente diferenciadas, apresentando miotubos que contraíam espontaneamente e expressavam marcadores específicos, tais como Myf5, MyoD e desmina. Com o objetivo de investigar in vitro a diferenciação do Toxoplasma, CME foram infectadas com taquizoítos de Toxoplasma e a estágio-conversão entre taquizoítos e bradizoítos analisadas até seis dias após infecção por imunofluorescência. A diferenciação dos taquizoítos teve início espontaneamente após 1 dia de infecção apresentando a seguinte taxa de vacúolos contendo bradizoítos: 0por cento (4h), 23,8(mais ou menos)3,4% (1dpi); 31,0(mais ou menos)2,0% (2dpi); 33,0(mais ou menos)3,5% (4dpi) e 46,0(mais ou menos)3,5% (6dpi). Após 2 e 4 dias de infecção, vacúolos contendo bradizoítos e rosetas de Toxoplasma em estágio conversão assincrônica foram detectados. Com o objetivo de checar se o tipo celular é determinante neste intrigante fenômeno, os mesmos experimentos foram realizados em dois outros tipos de células...