RESUMEN
The bacterium Herbaspirillum seropedicae is an endophytic diazotroph found in several plants, including economically important poaceous species. However, the mechanisms involved in the interaction between H. seropedicae and these plants are not completely characterized. We investigated the attachment of Herbaspirillum to maize roots and the invasion of the roots by this bacterium using H. seropedicae strain SMR1 transformed with the suicide plasmid pUTKandsRed, which carries a mini-Tn5 transposon containing the gene for the Discosoma red fluorescent protein (Dsred) constitutively expressed together with the kanamycin resistance gene. Integration of the mini-Tn5 into the bacterial chromosome yielded the mutant H. seropedicae strain RAM4 which was capable of expressing Dsred and could be observed on and inside fresh maize root samples. Confocal microscopy of maize roots inoculated with H. seropedicae three days after germination showed that H. seropedicae cell were attached to the root surface 30 min after inoculation, were visible in the internal tissues after twenty-four hours and in the endodermis, the central cylinder and xylem after three days.
Asunto(s)
Herbaspirillum , Zea mays/genética , Microscopía Confocal , Fijación del NitrógenoRESUMEN
As Escherichia coli Shiga Toxigênicas (STEC) são patógenos emergentes, causadores de diarréia e doenças graves como colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica. As STEC diferenciam-se das demais estirpes de E. Coli pela produção de um ou mais tipos de toxina denominadas toxina Shiga 1 e 2, codificadas pelos genes Stx1 e Stx2, respectivamente. O diagnóstico microbiológico das infecções causadas por STEC é dificultado pelo rápido decréscimo no número de organismos excretados nas fezes após o início dos sintomas e pela diversidade bioquímica e sorológica das estirpes de STEC. O objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo de PCR para a detecção de STEC que seja adequado para a rotina dos laboratórios clínicos. As culturas de estirpes de STEC e outros organismos usados como controles e das amostras de fezes diarréicas foram realizadas em ágar MacConkey e incubadas a 36ºC por 18-24 horas. A extração de DNA foi realizada pelo métoda da fervura. Na PCR foi utilizado um único par de iniciadores, ATACAGAGGGA/GGA/GATTTCGT e CC/ATGATGATGG/ACAATTCAG, capaz de detectar os genes Stx, Stx2 e seus variantes numa mesma reação através da ampliação de um fragmento de DNA de aproximadamente 220 pares de base (pb). A PCR foi realizada em volume de 50ml, contendo 10 ml de DNA, tampão Taq 1X; MgCl2, 1,5mM, dNTP 200mM, iniciadores 1mM cada, Taq DNA polimerase 2U. Empregou-se 1 ciclo de 94ºC por 5 minutos e 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 47ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos, seguidos de 1 ciclo de 72ºC por 10 minutos. Os produtos de amplificação foram detectados através de eletroforese em gel de agarose a 2%. DNA extraído das estirpes de STEC O157:H7 (Stx1, Stx2) e O111 (Stx1) permitiu a amplificação de um fragmento de cerca de 220pb, mas nenhum produto de amplificação foi produzido quando o DNA de E. coli ATCC 25922 e de outros organismos controle não produtores de Stx foi utilizado. Foram analisadas 123 cultura de fezes e 3 apresentaram amplificação do fragmento de DNA de cerca de 220 pb, sugerindo a presença de Stx. O protocolo descrito neste trabalho mostrou-se sensível, específico e adequado ao laboratório clínico.