Caracterización bioquímica y biológica del veneno de la serpiente Neotropical Macagua (Bothrops Colombiensis) de la región de Barlovento, estado Miranda, Venezuela / Biological and biochemical characterization of the Neotropical Macagua (Bothrops colombiensis) snake venom from Barlovento region, Miranda state, Venezuela

Introducción: el veneno de B. colombiensis no es solamente un elemento tóxico; en su composición existen múltiples componentes, que tienen un gran potencial terapéutico, principalmente en el tratamiento de patologías de la trombosis y la coagulación. Objetivos: estudiar una mezcla de venenos de Bothrops colombiensis de una ubicacion geográfica de Venezuela, a fin de hacer un barrido de sus actividades hemostáticas, que permitirá posteriormente purificar y caracterizar moléculas con actividad antitrombótica y anticoagulantes, entre otras, con potencial terapéutico. Métodos: el veneno a estudiar, es una mezcla de ellos obtenidos de serpientes provenientes de la Región de Barlovento, estado Miranda, Venezuela. Se caracterizó bioquímicamente por cromatografias de exclusión molecular, cromatografía de fase reversa C18 y por electroforesis a través de SDS­PAGE; y biológicamente por medio de actividades relacionadas con la hemostasia. Se analizaron los perfiles en relación a las actividades fibrinolítica, proteolítica sobre polvo azul y cadena ß de insulina, procoagulante, hemorrágica y letal. Resultados: la actividad hemorrágica, definida como la Dosis Hemorrágica Mínima fue de 8,7 mg/kg. La letalidad, definida como la Dosis Letal cincuenta fue 8,7 mg/kg. El veneno presentó actividad procoagulante y fibrinolítica. Las fracciones mostraron actividad fibrinolítica y proteolítica sobre polvo azul de ocultamiento y sobre la cadena ß de insulina. Conclusiones: las características biológicas de los componentes de este veneno le confieren un enorme potencial terapéutico, ya que contiene una alta actividad fibrinolítica y anticoagulante. Estos compuestos una vez purificados y caracterizados podrían explorarse como coadyuvantes en procesos trombolíticos, dado que disuelven coágulos de fibrina y degradan fibrinógeno, evitando episodios de retrombosis(AU)

Introduction: This paper is a screening of multiple toxic activities, of which some will be potentially useful for the management of coagulation pathologies. Objetives: A pool of Bothrops colombiensis venoms from a specific geographical location was studied, in order to carry out a hemostatic activities screening, allowing then to purify and characterise molecules with antithrombotic and anticoagulant activity, among others, which could have therapeutic potential. Methods: The venom was chromatographically by molecular exclusion and reverse phase C18 and SDS -PAGE characterized; its hemostatic activity was also established. Snakes were from the region of Barlovento, Miranda state, Venezuela. Profiles of fibrinolytic, proteolytic, procoagulant, hemorrhagic and lethal activities were analyzed. Hemorrhagic activity was 8.7 mg/kg. The LD50 was 8.7 mg/kg. The venom showed strongly procoagulant activity. Both, crude venom as fractions showed high fibrinolytic activity. The majority of the eluted fractions showed significant proteolytic activity in azure blue powder and on ß chain of insulin. Conclusions: The biological characteristics of the components of this venom confer enormous therapeutic potential because they contain a high fibrinolytic and anticoagulant activity. Most of these proteinases, once purified and characterized, could be explored as thrombolytic agents given that dissolves fibrin clots or prevent their formation(AU)

Biochemical and biological characterisation of lancehead (Bothrops venezuelensis Sandner 1952) snake venom from the Venezuelan Central Coastal range / Caracterización bioquímica y biológica del veneno de la serpiente "tigra mariposa" (Bothrops venezuelensis Sandner 1952) de la región central de la Cordillera de la Costa Venezolana

Se aislaron fracciones del veneno de Bothrops venezuelensis que demuestran ser un espectro abundante de proteínas con actividades variadas (coagulante, hemorrágica, fibrinolítica, proteolítica y de función plaquetaria), para el análisis de sus propiedades físico-químicas y biológicas, el veneno fue fraccionado por cromatografía de exclusión molecular, corrido en una electroforesis en gel y realizada una batería de ensayos biológicos. La DL50 del veneno de B. venezuelensis fue 6,39 mg/kg de peso corporal, fue determinada inyectando intraperitonealmente en ratones, diluciones seriadas de veneno de B. venezuelensis. Se colectaron doce fracciones a partir del veneno de B. venezuelensis mediante cromatografía de exclusión molecular. Las fracciones 1-5 y 7-9 tenían actividad hemorrágica. Todas las fracciones, con la excepción de las fracciones 3 y 6, tenían actividad fibrinolítica. Ninguna de las fracciones tuvo actividad de gelatinasa significativa, y sólo fracciones 4-6 demostraron actividad en polvo azul de ocultamiento. Con la excepción de las fracciones 1 y 4 , todas hidrolizaron la cadena β de la insulina. Cada fracción del veneno, así como el veneno crudo mostraron actividad procoagulante, cuando se probó en un analizador Sonoclot. Las fracciones 1, 3 , 5 y 9 inhibieron la función plaquetaria. En este estudio se señalan actividades biológicas de un veneno poco estudiado (B. venezuelensis) y sus fracciones. Al detectar actividades hemorrágicas, fibrinolíticas, procoagulantes, proteolíticas y de inhibición de la función plaquetaria. Este estudio preliminar abre el camino para la identificación de moléculas específicas que podrían tener potencial terapéutico en hemostasia y cáncer, que vienen siendo estudiados en nuestro grupo.

Venom fractions isolated from Bothrops venezuelensis were shown to contain a broad spectrum of proteins with varied activities. This study describes venom fractions with coagulant, haemorrhagic, fibrinolytic, proteolytic and antiplatelet activities, and analyses their physico-chemical properties and biological activities via molecular exclusion chromatography, gel electrophoresis and a bioassay battery. The LD50, determined by injecting intraperitoneally serial dilutions of B. venezuelensis venom into mice, was 6.39 mg/kg body weight. Twelve fractions were collected from B. venezuelensis venom using molecular exclusion chromatography. Of these, fractions 1-5 and 7-9 showed haemorrhagic activity, and all fractions except 3 and 6 showed fibrinolytic activity. However, none of the fractions had significant gelatinase activity, and only fractions 4-6 demonstrated activity on hide powder azure. With the exception of fractions 1 and 4, all fractions hydrolysed the insulin B-chain. In addition, all fractions as well as the crude venom showed strong procoagulant activity when tested using a Sonoclot Analyzer. Fractions 1, 3, 5 and 9 inhibited platelet function. In this study we have described the activities of the crude venom and its size-fractions from the scarcely studied B. venezuelensis. Haemorrhagic, fibrinolytic, procoagulant and proteolytic activities, and the inhibition of platelet function were detected. This preliminary study paves the way for the identification of specific molecules in B. venezuelensis venom that could have therapeutic potential for cancer and aberrant haemostasis treatment.

Clonamiento y expresión heterologa en saccharomyces cerevisiae de la acuaporina 2 de trypoanosoma cruzy (TcAQP2) / Cloning and heterologous expression in saccharomyces cerevisiae of the aquaporin 2 of trypanosoma cruzi (TcAQ2)

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la Enfermedad de Chagas, una entidad endémica no controlada y en crecimiento en Latinoamérica. El parásito, durante su ciclo de vida, se ve sometido a cambios bruscos en la osmolaridad. Tales situaciones de estrés osmótico ameritan sistemas fisiológicos que le permitan a estas células adaptarse y sovrevivir a la nueva situación. En distintos organismos, no de los elementos primordiales que intervienen en osmorregulación son las acuaporinas, proteínas de membrana pertenecientes a la familia MIP ("major intrinsec protein"), que permiten el paso selectivo de agua (acuaparinas clásicas) y otras moléculas no cargadas (acuagliceroporinas) a través de membranas biológicas, en función de gradientes osmóticos. En el genoma de T. cruzi existen cinco genes que presentan similitud con proteínas de la familia MIP. Una de estás ya ha sido caracterizada, TcAQP1 (Trypanosoma cruzi, acuaporina 1), un canal permeable solo al agua. En este artículo de investigación se inició el estudio de un segundo gen con similitud a acuaporina, al cual hemos denominado TcAQP2. El gen TcAQP2 codifica para una proteína de 276 aminoácios. Por medio de herramientas de bioinformática se realizó la predicción de las estructura de dicha proteína; posee características que permiten ubicarla dentro de la familia MIP. Se realizó el clonamiento y secuenciación de la TcAQP2, detectándose diez mutaciones silentes. Este hecho sugiere que se trata de mutaciones propias de la cepa de T. cruzi CL Brener utilizada en el desarrollo experimental de este trabajo. Posteriormente se realizó el subclonamiento de TcAQP2 en el plásmido de expresión en el modelo de levadura pYES.2 y se transformó en las células de saccharomyces cerevisiae. La expresión funcional de la TcAQP2 en dichas células, muestra evidencias de que está proteína interviene en osmorregulación cuando las células son expuestas a choques hiper-osmóticos e hipo-osmóticos...

Trypanosoma cruzi, the etiological agent of changes disease, es prevalent throughout Latin America. During its life cycle, the parasite undergoes extreme fluctuations in osmolarity, consequentrly physiological systems are required to assure its survival. In many organisms one of the more important systems involved in osmoregulation are aquaporins. These proteins are members of the major intrinsic protein family (MIP). Aquaporins can be divided in two groups according to its permeablity: the first one is only permeable to water (orthodox aquiaporins and the second one is permeable to water, glycerol, and other small, uncharged molecules (aquaglyceroporins). In the T cruzi genome there are 5 genes that encode proteins similar to aquaporins. One of these genes (Trypanosoma cruzi aquaporin 1, TcAQp1) has been already characerized as a channel that is only permeable to water. It was also demonstrated that TcAQP1 is involved in parasite osmoregulation. In this work, we started to investigate other gene with aquaporin similarity, which we named Trypanosoma cruzi aquaporin 2 (TcAQP2). The gene TcAQP2 encodes a protein of 276 aminoacids. The protein has six putative transmembrane domains and the two signature motifs asparagine-proline-alanine (NPA), which is the classical conserve motif in the MIP family proteins. Cloning and sequencing of the TcAQP2 gene allowed the detection of ten silent mutations in all clones analyzed, as compare to the sequence reported in data bank of the parasite, suggesting that they belong to the CL Brener strain used in this study. In order to analyze the TcAQP2 function, subcloning in the plasmid for heterologous expression in yeast (pYES.2) of this gene was performed. After transformation and functional expression alf TcAQP2 in Saccharomyces cerevisiae, cells were exposed to osmotic stress. The results indicate that this protein is involved in osmoregulation, and suggest that TcAQP2 participate as a channer for water and/or glycerol in...