MULTIPLEX SYBR® GREEN-REAL TIME PCR (qPCR) ASSAY FOR THE DETECTION AND DIFFERENTIATION OF Bartonella henselae AND Bartonella clarridgeiae IN CATS / PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex utilizando SYBR® Green para a detecção e diferenciação de Bartonella henselae e Bartonella clarridgeiae em gatos

A novel SYBR® green-real time polymerase chain reaction (qPCR) was developed to detect two Bartonella species, B. henselae and B. clarridgeiae, directly from blood samples. The test was used in blood samples obtained from cats living in animal shelters in Southern Brazil. Results were compared with those obtained by conventional PCR targeting Bartonella spp. Among the 47 samples analyzed, eight were positive using the conventional PCR and 12 were positive using qPCR. Importantly, the new qPCR detected the presence of both B. henselae and B. clarridgeiae in two samples. The results show that the qPCR described here may be a reliable tool for the screening and differentiation of two important Bartonella species.

Um novo teste baseado na reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) com SYBR ® Green foi desenvolvido para detectar duas espécies de Bartonella, B. henselae e B. clarridgeiae, diretamente em amostras de sangue. Este teste foi utilizado em amostras de sangue obtidas de gatos que vivem em abrigos de animais do sul do Brasil. Os resultados foram comparados aos obtidos pelo PCR convencional utilizado para a detecção de Bartonella spp. Das 47 amostras analisadas, oito foram positivas no PCR convencional e 12 foram positivas para qPCR. A reação de qPCR, permitiu a detecção da presença simultânea de B. henselae e B. clarridgeiae em duas destas amostras. Os resultados mostram que a qPCR aqui descrita pode ser uma ferramenta confiável para a detecção e diferenciação de duas espécies importantes de Bartonella spp.

Detection of human bocavirus and human metapneumovirus by real-time PCR from patients with respiratory symptoms in Southern Brazil

The introduction of newer molecular methods has led to the discovery of new respiratory viruses, such as human metapneumovirus (hMPV) and human bocavirus (hBoV), in respiratory tract specimens. We have studied the occurrence of hMPV and hBoV in the Porto Alegre (PA) metropolitan area, one of the southernmost cities of Brazil, evaluating children with suspected lower respiratory tract infection from May 2007-June 2008. A real-time polymerase chain reaction method was used for amplification and detection of hMPV and hBoV and to evaluate coinfections with respiratory syncytial virus (RSV), influenza A and B, parainfluenza 1, 2 and 3, human rhinovirus and human adenovirus. Of the 455 nasopharyngeal aspirates tested, hMPV was detected in 14.5 percent of samples and hBoV in 13.2 percent. A unique causative viral agent was identified in 46.2 percent samples and the coinfection rate was 43.7 percent. For hBoV, 98.3 percent of all positive samples were from patients with mixed infections. Similarly, 84.8 percent of all hMPV-positive results were also observed in mixed infections. Both hBoV and hMPV usually appeared with RSV. In summary, this is the first confirmation that hMPV and hBoV circulate in PA; this provides evidence of frequent involvement of both viruses in children with clinical signs of acute viral respiratory tract infection, although they mainly appeared as coinfection agents.

Uso de pool de soros em Programa Piloto de Comparação Interlaboratorial / Use of pool of blood serum in Pilot Program Interlaboratory Comparison

A avaliação interlaboratorial ou Teste de Proficiência (TP) é uma ferramenta utilizada como avaliação externa da qualidade, visando comparar o desempenho dos resultados obtidos pelos laboratórios de análises clínicas (LACs). Este trabalho objetivou realizar um programa piloto para comparação interlaboratorial em ensaios de Bioquímica, de acordo com os documentos da National Association os Testing Authorities – NATA (2004) e Associação Brasileira de Normas Técnicas – ABNT (1999). Participaram desse estudo seis LACs, sediados na região metropolitana de Porto Alegre. Como amostras para essa avaliação foram utilizados três lotes de pool de soros onde se avaliaram glicose, creatinina, ureia e colesterol total. Os dados enviados por cada participante foram avaliados utilizando-se estatística robusta, e seu desempenho classificado como Satisfatório, Questionável ou Insatisfatório, segundo o Escore Z obtido. Verificou-se que todos os laboratórios participantes obtiveram resultado Satisfatório para os parâmetros colesterol total e ureia. Para a glicose, um dos participantes obteve resultado Questionável (Z= 2). Resultado idêntico foi encontrado para acreatinina, onde um laboratório obteve escore Z= 2,6, classificado como Questionável. Com base nestes dados, concluímos que é possível utilizar, com sucesso, o pool de soros para ensaios de proficiência, permitindo ao laboratório comparar o seu desempenho com o de outros laboratórios semelhantes, implementando ações preventivas visando à melhoria dos seus procedimentos.

The interlaboratorial assessment or Proficiency Test (PT) is a tool used as external quality assessment, comparing the results obtained by the performance of clinical laboratories (LACs). The aim of this study was propose a pilot program for intercomparison trials of Biochemistry, according to the documents of the National Association os Testing Authorities – NATA (2004) and Associação Brasileira de Normas Técnicas – ABNT (1999). Participated in this study 6 LACs, based in the metropolitan region of Porto Alegre. As samples for this evaluation was used 3 batches of pool of blood serum which evaluated glucose, creatinine, urea and total cholesterol. The data sent by each participant were assessed using a robust statistical, and its performancerated as Satisfactory, Unsatisfactory or Questionable, according to the Z-score obtained. It was found that all participating laboratories obtained satisfactory results for the parameters total cholesterol and urea. For glucose, a result of the participants got questionable (Z = 2). Identical results was found for creatinine, where a laboratory had Z score=2.6, classified as Questionable. Based on these data, we conclude that it is possible to use successfully, the pool of blood serum for proficiency testing, allowing the laboratory to compare its performance with other similar laboratories, implementing preventive actions aimed at improving their procedures.

Prevalence of Bartonella henselae and Bartonella clarridgeiae in cats in the south of Brazil: a molecular study

Bartonella spp are the causative agent of cat scratch disease in humans. Cats are the natural reservoir of these bacteria and may infect humans through scratches, bites or fleas. Blood samples from 47 cats aged up to 12 months were collected for this study. All animals were lodged in municipal animal shelters in the Vale do Sinos region, Rio Grande do Sul, Brazil. Bartonella spp were detected by genus-specific polymerase chain reaction (PCR) and when the PCR was positive, the species were determined by DNA sequencing. A Giemsa-stained blood smear was also examined for the presence of intraerythrocytic elements suggestive of Bartonella spp infection. Phylogenetic analysis was also performed for all positive samples. Using molecular detection methods, Bartonella spp were detected in 17.02 percent (8/47) of the samples. In seven out of eight samples confirmed to be positive for Bartonella spp, blood smear examination revealed the presence of intraerythrocytic elements suggestive of Bartonella spp. Phylogenetic analysis characterized positive samples as Bartonella henselae (5) or Bartonella clarridgeiae (3). To the best of our knowledge, this is the first molecular study demonstrating the presence of Bartonella spp in cats from the Southern Region of Brazil.

Avaliação molecular de norovírus em pacientes com gastroenterite aguda / Molecular evaluation of norovírus in patients with acute gastroenteritis

INTRODUÇÃO: O norovírus foi recentemente identificado como o principal causador de surtos de gastroenterite aguda de origem não bacteriana em todo o mundo e está envolvido em episódios de origem alimentar. Neste estudo, foram avaliados pacientes com sintomas de gastroenterite aguda pelo período de um ano, a fim de se avaliar duas metodologias na identificação do NoV - a reação em cadeia por polimerase convencional e em tempo real -, incidência, sazonalidade e genótipo predominante. MÉTODOS: Após a extração do RNA, 50 amostras foram analisadas pela metodologia de PCR convencional e 365 amostras foram analisadas pela metodologia de PCR em tempo real. Todas as amostras que apresentaram resultado positivo pelas duas metodologias ou discordante foram sequenciadas, ao todo, 13 amostras foram sequenciadas. RESULTADOS: Das 50 amostras testadas pelas duas metodologias, 7 apresentaram resultado positivo pelo método convencional e 15 pelo método da PCR em tempo real. Do total de 365 amostras testadas pela metodologia de PCR, em tempo real, 48 foram positivas. Em relação às amostras sequenciadas, todas mostraram ser NoV do genogrupo II. Em relação à distribuição da incidência de amostras, positivas para NoV, ao longo do ano, pôde ser observada uma frequência de casos positivos maior na primavera, chegando a 29,7 por cento em novembro. CONCLUSÕES: Observamos que o PCR em tempo real é o método mais sensível para a identificação do Nov, que a incidência do NoV é de 13,2 por cento e o genogrupo II prevalece na população avaliada, sendo a primavera o período de maior taxa de infecção.

INTRODUCTION: Norovírus was recently identified as the main cause of outbreaks of acute gastroenteritis of non-bacterial origin worldwide and it is involved in episodes of foodborne origin. In this study, patients with symptoms of acute gastroenteritis were evaluated over a one-year period, in order to evaluate two methods for identifying norovírus (real-time and conventional polymerase chain reaction), along with its incidence, seasonality and predominant genotype. METHODS: After RNA extraction, 50 samples were analyzed using conventional PCR and 365 were analyzed using real-time PCR. All the samples that presented positive results using both methods or discordant results were sequenced. In all, 13 samples were sequenced. RESULTS: Out of the 50 samples tested using both methods, seven presented a positive result from the conventional method and 15 from real-time PCR. Out of the total of 365 samples tested using real-time PCR, 48 were positive. All of the sequenced samples were shown to present norovírus of genogroup II. Regarding the distribution of norovírus-positive sample incidence over the course of the year, higher frequency of positive cases was observed during the southern hemisphere spring, reaching 29.7 percent in November. CONCLUSIONS: We observed that real-time PCR was more sensitive for identifying norovírus. The incidence of norovírus was 13.2 percent and genogroup II predominated among the population evaluated, with the greatest infection rate in the southern hemisphere spring.

Comparação das técnicas de captura de híbridos e PCR para a detecção de HPV em amostras clínicas / Comparison of hybrid capture and PCR for HPV detection in clinical samples

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: São conhecidos mais de 100 tipos de papilomavírus humano (HPV), dos quais 30 têm sido reportados em infecções anogenitais. A infecção tem importância clínica, pois alguns tipos virais estão associados a lesões que podem progredir para o câncer cervical. Sabe-se que os métodos moleculares são muito importantes para o diagnóstico dessa infecção. O objetivo do estudo é comparar a detecção de HPV de alto risco pelo método de captura híbrida 2 (CH2) com a detecção do vírus pela reação em cadeia da polimerase convencional (PCRc) e em tempo real (PCR-TR). METODOLOGIA: Foram analisadas 56 amostras ectocervicais por CH2 e, após, por PCRc e PCR-TR. RESULTADOS: Ambas, PCRc e PCR-TR, apresentaram alta concordância entre si (95,1 por cento), enquanto a comparação entre as PCRs e a CH2 mostrou concordância razoável entre os resultados (PCRc = 90,2 por cento e PCR-TR = 87,8 por cento). DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: A CH é aceita para a detecção do HPV, entretanto pode ser menos sensível em comparação com as técnicas de PCR. A PCR-TR tem a vantagem sobre a PCRc em termos de velocidade, sendo também um pouco mais sensível. Devido à alta sensibilidade e à rapidez, os métodos de PCR poderiam ser usados para a triagem de HPV em amostras ectocervicais.

INTRODUCTION AND OBJECTIVE: More than 100 types of human papillomaviruses (HPV) are known, of which 30 have been reported in anogenital infections. The infection has clinical importance, inasmuch as some viral types are associated with lesions that can progress to cervical cancer. Molecular methods are considered an important tool for the diagnosis of this infection. The objective of this study was to compare the detection of high risk HPV using hybrid capture 2 with HPV detection by conventional and real time PCR. METHODOLOGY: 56 ectocervical samples were analyzed by hybrid capture and after that by conventional and real time PCR. RESULTS: Both PCR and RT-PCR showed a high degree of correlation (95.1 percent), whereas the comparison between PCR and HC2 showed a fair correlation (90.2 percent and 87.8 percent for PCR and RT-PCR, respectively). DISCUSSION AND CONCLUSIONS: HC is widely accepted for the detection of HPV, however, it may lack sensitivity in comparison with PCR techniques. RT-PCR has further advantages over the conventional PCR in terms of speed as well as it is slightly more sensitive. Due to their high sensitivity and fast response, PCR methods could be used as a screening method for HPV detection in ectocervical samples.

Conjuntivite por Achromobacter xylosoxidans: relato de caso / Conjunctivitis due to Achromobacter xylosoxidans: case report

Relatamos um caso de conjuntivite ocasionada por Achromobacter xylosoxidans em paciente imunocompetente usuária de lentes de contato rígidas. A bactéria foi isolada da solução utilizada para a desinfecção das lentes bem como do raspado conjuntival. A. xylosoxidans tem sido descrita em infecções oportunistas em pacientes imunodeprimidos, contudo pode ser confundida com outros bacilos gram-negativos, principalmente Pseudomonas aeruginosa, isoladas de infecções oculares em pacientes imunocompetentes. Devido ao reduzido perfil de sensibilidade aos antimicrobianos demonstrado pelo A. xylosoxidans, torna-se importante a identificação deste agente etiológico em quadros de conjuntivite.

We report here a case of conjunctivitis in an immunocompetent patient due to Achromobacter xylosoxidans, which was associated with the use of rigid contact lenses. The bacteria were isolated from the scraped conjunctival swab as well as from the lens cleaning fluid. A. xylosoxidans is an opportunistic pathogen, especially in immunocompromised patients; however, in isolates of ocular infections, from immunocompetent patients, it may be confused with other gram-negative organisms, particularly Pseudomonas aeruginosa. Due to an increased resistance against different antimicrobial agents, A. xylosoxidans must be fully identified and differentiated from other gram-negative isolates from ocular infections.

Corynebacterium striatum infecting a malignant cutaneous lesion: the emergence of an opportunistic pathogen / Corynebacterium striatum infectando lesão cutânea maligna: a emergência de um patógeno oportunista

We described a case of a 27-year old male patient with skin and soft tissue infection of a neoplastic lesion caused by Corynebacterium striatum, an organism which has been rarely described as a human pathogen. Identification was confirmed by DNA sequencing. Successful treatment with penicillin was achieved. The role of the C. striatum as an emerging opportunistic pathogen is discussed.

Descrevemos infecção de lesão neoplásica em paciente masculino de 27 anos, envolvendo pele e partes moles, causada por Corynebacterium striatum, um microrganismo raramente descrito como patógeno humano. A identificação foi confirmada por seqüenciamento de DNA. O paciente foi tratado com penicilina, com sucesso. O papel do C. striatum como patógeno oportunista é discutido.

Identification and detection of methicillin resistance in Non-Epidermidis coagulase-negative staphylococci

The NCCLS (2004) presented a new methodology to detect, by disk-diffusion agar, oxacillin-resistance using a cefoxitin disk. We identified coagulase-negative staphylococci (SCoN) to the species level and compared the use of cefoxitin disks (30 µg) with oxacillin disks (1 µg), agar dilution (minimum inhibitory concentration of oxacillin) and mecA gene detection in isolates of coagulase-negative bacteria other than Staphylococcus epidermidis (SCoNne). A total of 238 SCoNne was evaluated; oxacillin-resistance (the mecA gene) was detected in 71 percent of the isolates. All methods gave 100 percent sensitivity, based on presence of the mecA gene. The specificity of the cefoxitin disk was 100 percent, while the oxacillin disk gave a specificity of 91 percent and agar dilution oxacillin gave a specificity of 88 percent. We conclude that the cefoxitin disk is an efficient test, and it is an easy method for use in clinical laboratories to detect oxacillin-resistance in staphylococci.

Cutaneous infection caused by Corynebacterium pseudodiphtheriticum: a microbiological report / Infecção cutânea causada por Corynebacterium pseudodiphtheriticum: relato microbiológico

We report here a rare case of cutaneous infection due to Corynebacterium pseudodiphtheriticum. The patient presented to the clinical laboratory with a skin ulcer on his left leg. Gram-stained preparation of the purulent secretion revealed the presence of numerous rod-shaped Gram-positive organisms in the absence of any other species. The organism was grown in pure culture on sheep blood agar and was further identified as C. pseudodiphtheriticum using a commercial identification system (API-Coryne, BioMérieux, France). The infection was successfully treated with ciprofloxacin. This case emphasizes the importance of the clinical microbiology laboratory in correctly identifying Gram-positive organisms obtained in pure culture from skin ulcers.

Reportamos o isolamento de Corynebacterium pseudodiphtheriticum de um caso de infecção cutânea. O paciente apresentou-se ao laboratório clínico com uma úlcera na perna esquerda. A coloração de Gram do material revelou a presença de bacilos Gram-positivos e ausência de outras espécies bacterianas. O organismo foi isolado em cultura pura no ágar sangue de carneiro e foi identificado como C. pseudodiphtheriticum através de um sistema de identificação comercial (API-Coryne, BioMérieux, França). A infecção foi tratada com sucesso através do uso de ciprofloxacina. Este caso reforça a importância do laboratório de microbiologia clínica na identificação de organismos Gram-positivos isolados de cultura pura de amostras de úlceras cutâneas.

Utility of the ceftazidime-imipenem antagonism test (CIAT) to detect and confirm the presence of inducible AmpC beta-lactamases among enterobacteriaceae

Detection of AmpC beta-lactamase production by enterobacteria has been problematic. Contrary to ESBLs, no specific guidelines are available for detection and confirmation of AmpC production by clinical relevant microorganisms. Moreover, some bacterial species may produce inducible AmpC beta-lactamases that can be easily overlooked by routine susceptibility tests. We reported here a new test based on the strong inducible effect of imipenem on AmpC genes and the consequent antagonism with ceftazidime. This test is very simple and proved to be helpful in detecting AmpC-inducible enzymes among several species of clinical isolates.

Fatal case of bacteremia caused by an atypical strain of Corynebacterium mucifaciens

Corynebacterium species have often been considered normal skin flora or contaminants; however, in recent years they have been increasingly implicated in serious infections. Moreover, many new species have been discovered and old species renamed, especially after molecular biology techniques were introduced. Corynebacterium mucifaciens is mainly isolated from blood and from other normally-sterile body fluids; it forms slightly yellow, mucoid colonies on blood agar. We report a fatal case of bacteremia due to an atypical strain of C. mucifaciens. This strain had atypical colony morphology; analysis of the 16S rRNA gene was used to define the species.

Diphyllobothrium latum: relato de caso no Brasil / Diphyllobothrium latum: case report in Brazil

Difilobotriose é causada em humanos pela infeccão com vermes adultos do gênero Diphyllobothrium adquiridos pelo consumo de peixe cru ou mal cozido. Diphyllobothrium latum foi confirmado pelo exame dos proglotes grávidos e típicos ovos operculados nas fezes. O paciente havia comido crustáceos e peixes. É o relato do primeiro brasileiro infectado.

Fatal bacteremia due to Anaerobiospirillum succiniciproducens: first description in Brazil

Anaerobiospirillum succiniciproducens is an anaerobic, Gram-negative, spiral shaped bacteria, which is motile by means of bipolar tuffs of flagella. This organism appears to be a rare cause of bacteremia in humans, and it usually affects patients submitted to immunosuppressive therapy. Anaerobiospirillum succiniciproducens resembles Campylobacter spp. in Gram-stained preparations, however, it is considered resistant to most antimicrobial drugs that are used to treat Campylobacter infections. We observed Gram-negative, spiral shaped bacteria in Gram-stained preparations from blood culture flasks. Growth occurred only under anaerobic incubation, and identification to the species level was achieved by PCR amplification of the 16S rRNA gene, followed by direct sequencing and a GenBank homology search. To the best of our knowledge, this is the first reported Brazilian case of Anaerobiospirillum succiniciproducens bacteremia.

Application of broad-range bacterial PCR amplification and direct sequencing on the diagnosis of neonatal sepsis

Primers universais, que amplificam regiões conservadas de rDNA 23S, foram utilizados para analisar 306 amostras de cultivo de sangue obtidas de 295 neonatos com um ano ou menos de idade admitidos em unidades hospitalares de tratamento intensivo. O diagnóstico molecular baseado em seqüenciamento dos produtos de PCR foi comparado com os resultados obtidos do cultivo das amostras de sangue. Os resultados foram concordantes para 277 (90.5 per center) das 306 amostras testadas, incluindo 263 amostras PCR-negativo e cultura-negativa e 29 amostras cultura-positiva e PCR-positivo. Comparado com o método de cultivo, a técnica de PCR combinada com seqüenciamento, apresentou maior especificidade, 88 per center e 96,3 per center respectivamente, com valores preditivos positivos e negativos de 74,3 e 98,5 per center respectivamente. Concluímos que a técnica baseada em PCR utilizando amostras de cultivo de sangue, obtidas de neonatos com suspeita de sepse bacteriana, apresenta boa correlação com os métodos de cultivo convencionais. A metodologia de PCR/seqüenciamento apresenta aplicabilidade como técnica complementar para o diagnóstico da sepse neonatal. Esta metodologia fácil de ser executada fornece resultados confiáveis podendo ser recomendada para utilização no diagnóstico de amostras obtidas durante o tratamento antimicrobiano especialmente quando o resultado do cultivo permanece negativo. Apresenta, também, potencial de utilização na identificação de espécies bacterianas com problemas de classificação pelos métodos convencionais microbiológicos.

Quality control for microbiological culture media: Is it enough to follow the NCCLS M22-A2 procedures?

O uso de protocolos de controle de qualidade com padrões rígidos devem ser utilizados para garantir o isolamento dos microrganismos. Nosso objetivo foi o de avaliar um procedimento alternativo que nos permitisse detectar falhas de crescimento bacteriano em termos quantitativos, e comparação com o protocolo estabelecido pelo documento M22-A2 do NCCLS. Haemophilus influenzae apresentou diferença significativa de crescimento entre meio de cultivo de fontes distintas. Nos concluímos que, para alguns microrganismos fastidiosos, seja feita uma verificação quantitativa da capacidade de crescimento de cada meio de cultivo.

Quality control for microbiological culture media: Is it enough to follow the NCCLS M22-A2 procedures?

Stringent quality control protocols must be used in order to guaranty that a particular medium is able to recover all sort of organism that may be present in clinical samples. Our aim was to evaluate an alternative protocol that would allow us to detect medium failure to yield quantitative growth of selected pathogens, and compare with the document M22-A2 from NCCLS. The detection limit of Haemophilus influenzae was significantly different depending on media source. We conclude that for some fastidious microorganisms, quantitative verification of the growth capacity of the culture medium is advised.

O uso de protocolos de controle de qualidade com padrões rígidos devem ser utilizados para garantir o isolamento dos microrganismos. Nosso objetivo foi o de avaliar um procedimento alternativo que nos permitisse detectar falhas de crescimento bacteriano em termos quantitativos, e comparação com o protocolo estabelecido pelo documento M22-A2 do NCCLS. Haemophilus influenzae apresentou diferença significativa de crescimento entre meio de cultivo de fontes distintas. Nos concluímos que, para alguns microrganismos fastidiosos, seja feita uma verificação quantitativa da capacidade de crescimento de cada meio de cultivo.