Agro-industrial wastes as sources of bioactive compounds for food and fermentation industries / Resíduos agroindustriais como fontes de compostos bioativos para as indústrias de alimentos e de fermentação

ABSTRACT: Agro-industrial wastes are of great interest because they are important natural sources of bioactive compounds and can generate value-added byproducts. Recent studies have shown that byproducts generated by the food processing industry are rich in bioactive compounds, such as phenolic compounds, organic acids, and carotenoids, among others. The growing interest in replacing synthetic antioxidant and antimicrobial compounds with natural ones has stimulated a search for these bioactive compounds from plant sources, especially from fruit-processing wastes. The study aims to project the agro-industrial wastes as potential natural sources of antioxidants and antimicrobials and the feasible technological applications in food and fermentation industries, especially the bioethanol industry.

RESUMO: Resíduos agroindustriais são de grande interesse por serem importantes fontes naturais de compostos bioativos e assim gerar subprodutos de valor agregado. Estudos recentes mostraram que o processamento de alimentos gera subprodutos ricos em compostos bioativos tais como compostos fenólicos, ácidos orgânicos e carotenóides, entre outros. O crescente interesse em substituir compostos antioxidantes e antimicrobianos sintéticos por naturais tem estimulado a procura por esses compostos bioativos a partir de fontes vegetais, especialmente de resíduos de processamento de frutas. O objetivo desta revisão é destacar os resíduos agroindustriais como potenciais fontes naturais de antioxidantes e antimicrobianos assim como as possíveis aplicações tecnológicas nas indústrias de alimentos e de fermentação, especialmente a indústria do bioetanol.

Bioethanol strains of Saccharomyces cerevisiae characterised by microsatellite and stress resistance

Abstract Strains of Saccharomyces cerevisiae may display characteristics that are typical of rough-type colonies, made up of cells clustered in pseudohyphal structures and comprised of daughter buds that do not separate from the mother cell post-mitosis. These strains are known to occur frequently in fermentation tanks with significant lower ethanol yield when compared to fermentations carried out by smooth strains of S. cerevisiae that are composed of dispersed cells. In an attempt to delineate genetic and phenotypic differences underlying the two phenotypes, this study analysed 10 microsatellite loci of 22 S. cerevisiae strains as well as stress resistance towards high concentrations of ethanol and glucose, low pH and cell sedimentation rates. The results obtained from the phenotypic tests by Principal-Component Analysis revealed that unlike the smooth colonies, the rough colonies of S. cerevisiae exhibit an enhanced resistance to stressful conditions resulting from the presence of excessive glucose and ethanol and high sedimentation rate. The microsatellite analysis was not successful to distinguish between the colony phenotypes as phenotypic assays. The relevant industrial strain PE-2 was observed in close genetic proximity to rough-colony although it does not display this colony morphology. A unique genetic pattern specific to a particular phenotype remains elusive.

Deterioration and fermentability of energy cane juice / Deterioração e fermentabilidade do caldo de cana energia

ABSTRACT: The main interest in the energy cane is the bioenergy production from the bagasse. The juice obtained after the cane milling may constitute a feedstock for the first-generation ethanol units; however, little attention has been dedicated to this issue. In order to verify the feasibility of the energy cane juice as substrate for ethanol production, the objectives of this research were first to determine the microbiological characteristics and deterioration along the time of the juices from two clones of energy cane (Type I) and second, their fermentability as feedstock for utilization in ethanol distilleries. There was a clear differentiation in the bacterial and yeast development of the sugarcane juices assayed, being much faster in the energy canes than in sugarcane. The storage of juice for 8 hours at 30oC did not cause impact in alcoholic fermentation for any sample analyzed, although a significant bacterial growth was detected in this period. A decrease of approximately seven percentage points in the fermentative efficiency was observed for energy cane juice in relation to sugarcane in a 24-hour fermentation cycle with the baking yeast. Despite the faster deterioration, the present research demonstrated that the energy cane juice has potential to be used as feedstock in ethanol-producing industries. As far as we know, it is the first research to deal with the characteristics of deterioration and fermentability of energy cane juices.

RESUMO: O principal interesse na cana energia reside na produção de bioenergia a partir do bagaço. O caldo obtido após a moagem da cana pode se constituir em substrato para as unidades de produção de etanol de primeira geração, no entanto, pouca atenção tem sido dispensada a esta questão. O presente trabalho avaliou o caldo de cana energia obtido de dois clones Tipo I como substrato para a produção de etanol, com base na determinação das suas características microbiológicas e deterioração ao longo do tempo, em comparação com o caldo de cana-de-açúcar (variedade RB867515). Foi observada uma clara diferenciação quanto ao crescimento bacteriano e de leveduras nas amostras de caldo analisadas, sendo o crescimento mais rápido no caldo de cana energia que no caldo de cana-de-açúcar. A manutenção do caldo por 8 horas a 30oC não causou impacto sobre a fermentação etanólica para quaisquer das amostras analisadas, apesar do crescimento significativo de bactérias. Houve um decréscimo de aproximadamente sete pontos percentuais na eficiência da fermentação com caldo de cana energia em um ciclo fermentativo de 24 horas com a levedura da panificação, em relação ao caldo da cana-de-açúcar. Apesar de a deterioração do caldo da cana energia ter sido mais rápida que a apresentada pelo caldo de cana-de-açúcar, o presente trabalho demonstrou que o caldo de cana energia tem potencial para ser utilizado como substrato nas indústrias produtoras de etanol. Do que se tem conhecimento, esse é o primeiro trabalho que trata das características de deterioração e fermentabilidade do caldo de cana energia.

Characteristics of Saccharomyces cerevisiae yeasts exhibiting rough colonies and pseudohyphal morphology with respect to alcoholic fermentation

Among the native yeasts found in alcoholic fermentation, rough colonies associated with pseudohyphal morphology belonging to the species Saccharomyces cerevisiae are very common and undesirable during the process. The aim of this work was to perform morphological and physiological characterisations of S. cerevisiae strains that exhibited rough and smooth colonies in an attempt to identify alternatives that could contribute to the management of rough colony yeasts in alcoholic fermentation. Characterisation tests for invasiveness in Agar medium, killer activity, flocculation and fermentative capacity were performed on 22 strains (11 rough and 11 smooth colonies). The effects of acid treatment at different pH values on the growth of two strains ("52" -rough and "PE-02" smooth) as well as batch fermentation tests with cell recycling and acid treatment of the cells were also evaluated. Invasiveness in YPD Agar medium occurred at low frequency; ten of eleven rough yeasts exhibited flocculation; none of the strains showed killer activity; and the rough strains presented lower and slower fermentative capacities compared to the smooth strains in a 48-h cycle in a batch system with sugar cane juice. The growth of the rough strain was severely affected by the acid treatment at pH values of 1.0 and 1.5; however, the growth of the smooth strain was not affected. The fermentative efficiency in mixed fermentation (smooth and rough strains in the same cell mass proportion) did not differ from the efficiency obtained with the smooth strain alone, most likely because the acid treatment was conducted at pH 1.5 in a batch cell-recycle test. A fermentative efficiency as low as 60% was observed with the rough colony alone.

Release of potassium from rock powder by the yeast Torulaspora globosa

The alteration of minerals in rocks and the availability of elements for plant nutrition require long periods of time, and microorganisms are thought to induce the release of potassium and phosphate from rocks. In this context, this work evaluates the role of the yeast Torulaspora globosa, isolated from the sugar cane rhizosphere, in the solubilization of potassium from alkaline ultramafic rock powder. The experiments were performed in liquid medium, with or without agitation, at 30°C with the following treatments: culture medium + alkaline ultramafic; culture medium + yeast suspension; and culture medium + yeast suspension + alkaline ultramafic. The results showed that as much as 38% of the total potassium in the rock was released in the medium with the yeast during a 15-day period of incubation. Acid production may be the mechanism by which the yeast solubilizes potassium because the total acidity increased during the sampling period. Agitation (which increased oxygen availability) resulted in approximately 20% more biosolubilization of the alkaline ultramafic rock than with the static culture. These data indicate the potential for this yeast in biosolubilization processes and biofertilizer production.

Effect of the spontaneous fermentation and the ageing on the chemo-sensory quality of Brazilian organic cachaça / Efeito da fermentação natural e do envelhecimento sobre a qualidade química e sensorial de cachaça orgânica Brasileira

This study verified the effect of the spontaneous fermentation/natural ferment (NF) on the chemo-sensory quality of cachaça, comparing to the commercial ferment (CF). The effect of ageing (maturation) was also analysed in the beverage. Microbiological analysis (plating on selective media for total/wild yeast and bacteria counting) and physico-chemical analysis (pH, acidity and soluble solids) were performed in the samples of the must and the ferment collected during three cycles of fermentation in a semi-industrial scale. Samples of cachaça were stored in 5-L oak containers for 45 days, subsequently analyzing the physico-chemical characteristics (pH, acidity, alcohol content, copper and secondary compounds) and sensory acceptability (aroma, flavour, colour, body and global impression). The fermentation with NF showed higher number of wild yeasts; however there was no difference in the number of bacteria comparing to CF. An intense acidification occurred during the preparation of NF, which was also observed in the initial cycles of fermentation, but decreased afterwards. Greater alterations in cachaça composition were found to be more exclusively related to the maturation than to the type of ferment, except for the acidity. However, there was a significant loss of aroma, flavour and global impression after maturation but only in cachaça produced with the CF. The results revealed a strong interaction between ferment and maturation of the beverage, suggesting that substances produced by the microorganisms from different inocula during fermentation reacted differently with the wood components of the barrels influencing the sensory attributes.

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da fermentação espontânea/fermento natural (NF) sobre a qualidade fisico-química e aceitabilidade da cachaça, comparando-se com o fermento comercial (CF). O efeito do envelhecimento (maturação) da bebida foi também avaliado. Análises microbiológicas (plaqueamento em meios seletivos para contagem de leveduras totais/selvagens e bactérias) e físico-químicas (pH, acidez e sólidos solúveis) foram conduzidas nas amostras do mosto e do fermento coletadas durante três ciclos fermentativos (escala semi-industrial). Amostras de cachaça foram armazenadas em barris de carvalho de 5 litros por 45 dias, seguindo-se a análise físico-química (pH, acidez, teor alcoolico, cobre e compostos secundários) e de aceitabilidade sensorial (aroma, sabor, cor, corpo e impressão global). A fermentação com NF mostrou maior número de leveduras selvagens; no entanto, não houve diferença significativa no número de bactérias quando comparada com CF. Uma intensa acidificação foi observada durante o preparo de NF, a qual foi verificada nos ciclos iniciais da fermentação, decrescendo a seguir. As alterações na composição da cachaça foram mais significativas em relação à maturação do que ao tipo de fermento, com exceção da acidez. No entanto, houve uma perda significativa de aroma, sabor e impressão global após a maturação na cachaça produzida com CF. Os resultados revelaram uma forte interação entre fermento e envelhecimento (maturação) da bebida, sugerindo que substâncias produzidas pelos microrganismos a partir de inóculos diferentes reagiram diferentemente com componentes da madeira dos barris, influenciando nos atributos sensoriais de aceitabilidade.

Yeast composition of sugar cane juice in relation to plant varieties and seasonality / Composição de leveduras do caldo em relação às variedades de cana e sazonalidade

In the production of the artisanal cachaça, a beverage obtained after distillation of the fermented sugar cane juice, natural starter ferment ("fermento caipira") is utilized, in which crushed corn, rice bran and citric fruit juice are added to sugar cane juice. The primary microbial source is the juice itself, and although the cachaça sensorial quality is recognized when this ferment is utilized, difficulties in the quality control due to the high level of contaminants and extensive preparation periods are reported. In this context, this work aimed the evaluation of the yeast composition and physico-chemical characteristics of the juice extracted from 10 sugar cane RB-varieties during the harvest season in an area under organic management, seeking for information to contribute to the varietal management allowing a faster and efficient ferment preparation. A significant decrease in the yeast numbers in the juice was observed when the maximal point of maturity was reached for the majority of the varieties. However, the proportion (%) of Saccharomyces increased with the cane maturity, recommending the early and medium maturity varieties (RB835054, RB835486, RB845210 and RB855156) to be utilized at the beginning of the harvest period for the ferment preparation, which could result in diminished preparation time and faster fermentation. The variety RB845210 is indicated because it also presented high reducing sugar and protein concentrations in the juice. The varietal management can facilitate the production and performance of the natural starter ferment, in order to contribute for the organic cachaça production.

Na produção artesanal de cachaça, bebida obtida através da destilação do caldo de cana-de-açúcar fermentado, tradicionalmente utiliza-se o fermento natural ou também chamado de caipira, resultado da mistura de vários ingredientes como milho moído, farelo de arroz e suco de frutas cítricas com caldo de cana. A fonte primária de microrganismos é o próprio caldo da cana, e embora se reconheça a qualidade sensorial da bebida quando este tipo de fermento é utilizado, há alguns inconvenientes como dificuldades no controle de qualidade devido ao alto nível de contaminantes e longos períodos de preparação. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição de leveduras e as características físico-químicas do caldo em relação às variedades de cana orgânica (10 variedades RB) e à sazonalidade, no intuito de gerar informações para o manejo de variedades que permita o preparo do fermento caipira de forma mais eficiente e rápida. Os resultados indicaram uma diminuição significativa no número de leveduras próximo ao ponto máximo de maturação da cana-de-açúcar para a maioria das variedades. Porém, observou-se que a proporção (%) de Saccharomyces aumentou em decorrência da maturação da cana. Sugere-se as variedades precoces e precoces/médias (RB835054, RB835486, RB845210 e RB855156) a serem utilizadas no início da safra para o preparo do fermento caipira, o que poderia proporcionar uma diminuição no tempo de preparo do fermento e uma fermentação mais rápida. A variedade RB845210 é indicada por apresentar também maior concentração de açúcar redutor e proteína no caldo. O manejo varietal pode facilitar a produção e eficiência do fermento caipira, contribuindo assim para a produção de cachaça orgânica.

Bioprospection of yeasts as biocontrol agents against phytopathogenic molds

Yeasts isolated from sugar cane and maize rhizosphere, leaves and stalks were screened against the phytopathogenic molds Colletotrichum sublineolum and Colletotrichum graminicola, both causal agents of the anthracnose disease in sorghum and maize, respectively. Strains identified as Torulaspora globosa and Candida intermedia were able to inhibit the mold growth, with the first species also exhibiting killer activity. No previous report on the application and potentiality of these yeasts as biocontrol agents were found neither the killer phenotype in Torulaspora globosa.

Inhibition of bacteria contaminating alcoholic fermentations by killer yeasts

The aim of this work was to study the in vitro antibacterial activity possessed by killer yeast strains against bacteria contaminating alcoholic fermentation (Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum and Leuconostoc mesenteroides), in cell X cell and cell X crude toxin preparations. The bacteria were not inhibited by any S. cerevisiae killer strains (5 out of 11). The inhibition caused by two crude toxin preparations (Trichosporon figueirae and Candida sp) against L. plantarum was surprisingly high but not in the same extent for B. subtilis, especially with three killer strains (Candida glabrata, Pichia anomala and Candida sp). L. mesenteroides and L. fermentum strains were neither inhibited in cell X cell nor crude toxin X cell tests. The results suggested that killer activity of yeasts might operate over bacteria and it could be used for the biocontrol of contaminating bacteria from alcoholic fermentation if additional tests on toxin application in fermentation shown to be successful. A wider panel of S. cerevisiae killer strains should be used to confirm that they were really unable to control the growth of these Gram-positive bacteria.

Este estudo mostrou a atividade antibacteriana in vitro de linhagens de leveduras killer contra bactérias contaminantes da fermentação alcoólica (Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum and Leuconostoc mesenteroides), em testes célula X célula e célula X toxina bruta. As bactérias não foram inibidas por linhagens killer de Saccharomyces cerevisiae (5 dentre 11). Os preparados brutos de toxina de duas leveduras (Trichosporon figueirae e Candida sp) causaram uma alta inibição no crescimento de L. plantarum, mas não na mesma extensão para B. subtilis, especialmente para três leveduras killer (Candida glabrata, Pichia anomala e Candida sp). Linhagens de L. mesenteroides e L. fermentum não foram inibidas em nenhum dos testes. Os resultados obtidos neste estudo sugerem a ação de toxinas killer de leveduras contra bactérias, a qual poderia ser utilizada para o biocontrole de bactérias contaminantes da fermentação alcoólica se testes posteriores de aplicação da toxina dentro das dornas de fermentação se mostrarem eficientes. Um número maior de linhagens killer de S. cerevisiae deveria ser utilizado para confirmar se elas realmente são incapazes de controlar o crescimento destas bactérias Gram-positivas.

Chlorine dioxide against bacteria and yeasts from the alcoholic fermentation / Dióxido de cloro contra bactérias e leveduras da fermentação alcoólica

The ethanol production in Brazil is carried out by fed-batch or continuous process with cell recycle, in such way that bacterial contaminants are also recycled and may be troublesome due to the substrate competition. Addition of sulphuric acid when inoculum cells are washed can control the bacterial growth or alternatively biocides are used. This work aimed to verify the effect of chlorine dioxide, a well-known biocide for bacterial decontamination of water and equipments, against contaminant bacteria (Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum and Leuconostoc mesenteroides) from alcoholic fermentation, through the method of minimum inhibitory concentration (MIC), as well as its effect on the industrial yeast inoculum. Lower MIC was found for B. subtilis (10 ppm) and Leuconostoc mesenteroides (50 ppm) than for Lactobacillus fermentum (75 ppm) and Lactobacillus plantarum (125 ppm). Additionally, these concentrations of chlorine dioxide had similar effects on bacteria as 3 ppm of Kamoran® (recommended dosage for fermentation tanks), exception for B. subtilis, which could not be controlled at this Kamoran® dosage. The growth of industrial yeasts was affected when the concentration of chlorine dioxide was higher than 50 ppm, but the effect was slightly dependent on the type of yeast strain. Smooth yeast colonies (dispersed cells) seemed to be more sensitive than wrinkled yeast colonies (clustered cells/pseudohyphal growth), both isolated from an alcohol-producing unit during the 2006/2007 sugar cane harvest. The main advantage in the usage of chlorine dioxide that it can replace antibiotics, avoiding the selection of resistant populations of microorganisms.

A produção de etanol no Brasil é atualmente realizada pelo processo de fermentação em batelada alimentada ou contínuo, com reciclo de células de leveduras, de forma que contaminantes bacterianos são também reciclados e podem causar problemas devido à competição pelo mesmo substrato. O controle bacteriano é feito pela adição de ácido sulfúrico na lavagem das células do fermento ou utilizando-se biocidas. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito do dióxido de cloro, um biocida muito utilizado para a descontaminação da água e equipamentos, contra bactérias contaminantes da fermentação alcoólica (Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum e Leuconostoc mesenteroides), através do método da concentração inibitória mínima (CIM), assim como seu efeito sobre o fermento industrial. Valores menores de CIM foram encontrados para Bacillus subtilis (10 ppm) e Leuconostoc mesenteroides (50 ppm) do que para Lactobacillus fermentum (75 ppm) e Lactobacillus plantarum (125 ppm). Estas concentrações tiveram o mesmo efeito inibidor que 3 ppm de Kamoran®, com exceção de B. subtilis, no qual não se observou inibição de crescimento à esta concentração. As leveduras industriais apresentaram inibição no crescimento em concentrações superiores a 50 ppm, porém esta pareceu ser dependente do tipo de linhagem de levedura. Colônias cremosas (células dispersas) foram ligeiramente mais sensíveis que as colônias rugosas (células agrupadas/pseudohifas), ambas isoladas de uma unidade produtora de álcool durante a safra de cana-de-açúcar 2006/2007. A principal vantagem na utilização deste produto está na eliminação do uso de antibióticos, evitando a geração de populações resistentes de microrganismos.

Filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae

O dimorfismo em fungos é um fenômeno complexo acionado por um grande número de fatores ambientais e consiste num padrão alternante e reversível de crescimento, oscilando entre formas elípticas e filamentosas de células. É de grande importância o entendimento dos mecanismos que regulam esses eventos devido as suas implicações na patogenicidade, diferenciação celular e indústria. Células diplóides de Saccharomyces cerevisiae mudam de células brotantes para pseudohifas quando em condições limitantes de nitrogênio, o que confere às células uma vantagem na procura por alimento. A deficiência de nitrogênio é 'percebida' por pelo menos dois caminhos sinalizadores: 'MAP kinase' (MAPK) e 'PKA' (cAMP-dependent protein kinase A). O resultado dessa sinalização é a expressão de genes específicos para filamentação, cujos perfis de expressão mudam e são acompanhados por um retardo da fase G2 do ciclo celular e um período prolongado de crescimento polarizado. Células haplóides mostram um tipo de crescimento similar após prolongada incubação em meio rico. As células formam cadeias e invadem o ágar na borda da colônia, mas não se tornam alongadas. Esse tipo de crescimento é conhecido como crescimento invasivo haplóide. Os álcoois podem também induzir crescimento filamentoso em S. cerevisiae, ocasionando uma morfologia alongada e aberrante. Nesse artigo revisamos as três formas de crescimento filamentoso incluindo os caminhos envolvidos na percepção, sinalização e transdução do sinal durante o crescimento filamentoso.

Determination of yeast killer activity in fermenting sugarcane juice using selected ethanol-making strains

A atividade 'killer' poderia garantir às leveduras fermentativas uma vantagem competitiva sobre outras linhagens durante a fermentação etanólica, no entanto, pouco se sabe sobre o papel do sistema 'killer' nesse tipo de fermentação alcoólica. A seleção de linhagens 'killer' altamente produtivas pode ser uma abordagem interessante. Vinte e quatro dentre 342 leveduras isoladas do processo fermentativo mostraram atividade 'killer' e 3 delas foram selecionadas para a avaliação da eficiência fermentativa em sistema de batelada com reciclo de células, em escala de frascos e fermentador. As 3 linhagens 'killer' selecionadas não apresentaram resultados similares àqueles apresentados pelo fermento prensado (panificação) em relação aos rendimentos em etanol (0,07-0,18; 0,12-0,20; 0,10-0,13; 0,22-0,25 g/g, respectivamente) e biomassa (0,19-0,26; 0,33-0,39; 0,13-0,27; 0,47-0,61 g/g, respectivamente) e eficiência fermentativa (12,3-36,3; 21,0-40,0; 19,3-26,3; 47,6-54,0 %, respectivamente) em caldo de cana-de-açúcar, em frascos. Em fermentador, observou-se o mesmo comportamento. No entanto, elas mostraram alta viabilidade celular e atividade 'killer' (usando filtrado livre de células) ao longo dos ciclos fermentativos, a despeito das condições desfavoráveis do meio, como alta variação de pH do meio (de 5,5-6,0 a 3,0-4,0), baixa aeração e temperatura mais alta (30oC), as quais não são as ideais para a produção/atividade das toxinas 'killer'. Uma linhagem de Pichia (CCA 510) mostrou os melhores resultados entre as linhagens 'killer' testadas, além de exibir uma poderosa atividade 'killer' contra 92% de leveduras fermentativas isoladas do processo e contra o fermento prensado. Demonstrou também atividade 'killer' (usando preparado de toxina bruta) em temperaturas elevadas (38oC) e baixo pH (4,0) após 72 horas de incubação, sob condições proliferativas e não-proliferativas. Os resultados permitem indicar que a atividade 'killer' deve ser uma característica a ser avaliada na seleção de linhagens para a fermentação etanólica, além de outras características baseadas na produtividade, uma vez que pode assegurar a permanência da linhagem selecionada durante o processo.

Hyphal-like extension and pseudohyphal formation in industrial strains of yeasts induced by isoamyl alcohol

Yeasts can produce pseudohyphae and hyphal-like extensions under certain growth conditions like isoamyl alcohol (IAA) induction, a chief constituent of fusel oil, which is a subproduct from the ethanolic fermentation. The morphology switch from yeast to a filamentous form can be troublesome to the process. In this work it was studied the influence of fusel alcohols, nitrogen sources (ammonium sulphate and leucine) and glifosate (a chemical maturator for sugar cane) added to a complex medium on some industrial strains of yeasts isolated from the fermentative process. Two industrial strains showed transition to hyphal-like extensions or pseudohyphae (clusters of cells) upon addition of IAA from 0.3 to 0.9 percent /v. The alterations were reversible when the yeasts were reinoculated in YEPD without IAA. Although pseudohyphae are a result of nitrogen-limited medium, we observed them as a result of IAA addition. No influence of the nitrogen source or isopropilic alcohol or glifosate was detected for any strain studied in the concentrations used