Desenvolvimento de embriões de camundongas após manutenção em diferentes soluções de manipulação / Development of mice embryos after maintenance in different manipulation solutions

Avaliou-se a eficácia de duas soluções de manipulação (SM) de embriões de camundongas nos estádios de blastocisto inicial (Bin), mórula compacta grau I (McI) e II (McII), distribuídos aleatoriamente em três tratamentos (T), de acordo com a solução de manutenção. No T1 usou-se PBS modificado (controle); no T2, SME e no T3, SME enriquecida. Os embriões foram mantidos durante quatro horas na solução de manutenção e posteriormente classificados quanto ao estádio de desenvolvimento e à qualidade embrionária. Logo após, foram cultivados em meio TCM 199 e classificados novamente quanto ao estádio de desenvolvimento e à qualidade embrionária. A taxa de desenvolvimento dos embriões após manutenção por quatro horas em solução de manipulação foi menor (P<0,05) nos embriões do controle, comparada à de embriões do SME e SME enriquecida, diferença esta não observada (P>0,05) após o cultivo in vitro. Os embriões McII do T3 tiveram maior desenvolvimento (P<0,05) em relação aos embriões do T1 e T2, indicando o efeito benéfico do enriquecimento da solução SME. Conclui-se que as soluções de manipulação SME e SME enriquecida influenciaram beneficamente o desenvolvimento de embriões.

The effect of embryo manipulation solution followed by in vitro culture in mice embryos was studied. The embryos at early blastocyst (Bin), and compact morula grades I (McI) and II (McII) were randomly assigned into three treatments. T1 used modified PBS (control), T2 used EMS, and T3 used EMS supplemented. In each treatment, the embryos were kept in manipulation solution for four hours. Finishing the manipulation period, the embryos were classified according the development stage and quality. Following, the embryos were cultured in TCM 199. After the culture period, the embryos were evaluated according to quality and development stage. The development rate for Bin, McI, and McII after maintenance for four hours in manipulation solution was lower for control embryo (P>0.05) as compared to EMS and EMS supplemented embryos. After in vitro culture, no differences (P>0.05) on embryo development rate among control, EMS, and EMS supplemented were observed. Moreover, McII from EMS supplemented had a higher development (P<0.05) (93 percent) as compared to control (82.5 percent) and EMS (83.9 percent), suggesting a beneficial effect of EMS supplemented. EMS and EMS supplemented embryos had a positive effect on embryo development, showing higher embryo development than those in PBS solution.

Nova técnica para contagem do número de células de blastocistos / A new technique to count the number of cells of blastocysts

A simplified, fast, and innovative method was developed to count the total cell number in blastocysts. Murine blastocysts (N = 195) were used in this study. They were obtained after 10h culture of initial blastocysts, compact morulae grades I and II recovered from superovulated mouse. After culture, the blastococysts were selected to test the new proposal of counting. The process was done after embryo fixation in a sodium citrate solution, and adherence in glass slide. Following, the coloration was done using a fast panoptic coloration kit. As a result, it was possible to identify the blastomeres and count them in each blastocyst. This method provided a fast and effective analysis of the total cell number when compared with other techniques. Moreover, this new method shows advantages related to the cell visualization, which can be done in more simple equipment like stereoscopic microscope. Other interesting observed point was the long period of time and quality that the coloration stays on slides, considering other techniques.

Cultivo in vitro de ovócitos bovinos em diferentes sistemas: I- efeito na maturaçäo nuclear / In vitro cultivation of bovine oocytes under different conditions: I-Effect on nuclear maturation

Foram utilizados ovócitos com o cumulus compacto, distribuídos em três tratamentos: I - meio de cultivo constituído de meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento); II - meio de cultivo acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml); III - monocamada de células da granulosa em meio de cultivo. As formas foram obtidas em zero, 12, 18, 24 e 30 horas de cultivo in vitro, para exame da configuraçäo cromossômica. Foram utilizados 1251 ovócitos com os seguintes resultados de maturaçäo nuclear, para os tratamentos I, II e III, respectivamente: 12 horas de cultivo, 1 (1,08 por cento), 1 (1,08 por cento) e 2 (2,17 por cento); 18 horas, 70 (76,92 por cento), 50 (56,82 por cento) e 46 (54,12 por cento); 24 horas, 93 (89,42 por cento), 81 (93,10 por cento) e 71 (85,54 por cento); 30 horas, 77 (89,53 por cento), 78 (91,76 por cento) e 63 (90,00 por cento). Os resultados foram elevados e significativos (P<0,01) na taxa de maturaçäo com 18 horas de cultivo, para os ovócitos cultivados segundo o tratamento I. Eles sugerem a fecundaçäo in vitro após 18 horas de cultivo, no caso da maturaçäo em meio sem células da granulosa, diferenciando do tempo usualmente utilizado de 24 horas, quando se utiliza o co-cultivo com células da granulosa

Cultivo in vitro de ovócitos bovinos em diferentes sistemas: II - aspectos ultra-estruturais / In vitro cultivation of bovine oocytes, under different conditions: II - ultrastructural aspects

Para avaliar o efeito de sistemas de cultivo in vitro na ultra-estrutura celular, foram cultivados ovócitos com o cumulus compacto distribuídos em três tratamentos: I - meio de cultivo constituído de meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento); II - meio de cultivo acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml); III - monocamada de células da granulosa em meio de cultivo. As amostras foram obtidas em zero, 12, 18, 24 e 30 horas de cultivo e submetidas aos procedimentos para a análise ultra-estrutural. As características verificadas nos ovócitos foram caracterizadas em cinco configuraçöes (C1 a C5), levando em consideraçäo vários estádios de maturaçäo. Para esta classificaçäo foram consideradas as modificaçöes ultra-estruturais no interior do ovócito, sendo C1 um ovócito sem alteraçäo indicativa de reativaçäo da meiose, C2, C3 e C4 estádios intermediários e C5 um ovócito maduro caracterizado principalmente pela configuraçäo cromossômica em metáfase II e pela distribuiçäo dos grânulos corticais em posiçöes solitárias nas proximidades da membrana citoplasmática. Foram verificados os seguintes resultados, para os tratamentos I, II e III, respectivamente: zero hora (C1 e C2, C1 e C2, C1 e C2), 12 horas (C4, C3 e C3), 18 horas (C5, C4 e C4), 24 horas (C5, C5 e C5) e 30 horas (C5, C5 e C5). No cultivo sem células da granulosa, as características que configuram um ovócito maduro sob aspecto ultra-estrutural já ocorrem com 18 horas de cultivo

Cultivo in vitro de ovócitos bovinos em diferentes sistemas: III - capacidade de desenvolvimento após a fecundaçäo / In vitro cultivation of bovine oocytes under different conditions: III - development after fecundation

Para avaliar o efeito de sistemas de maturaçäo in vitro, na capacidade de desenvolvimento após a fecundaçäo, foram cultivados ovócitos com o cumulus compacto, distribuídos em três tratamentos: I - meio de cultivo constituído de meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento); II - meio de cultivo acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml); III - monocamada de células da granulosa em meio de cultivo. Após 18 horas de maturaçäo no tratamento I e 24 horas nos tratamentos II e III, os ovócitos foram fecundados in vitro, com sêmen congelado. Dezoito horas após o início da inseminaçäo, os zigotos foram cultivados in vitro por sete dias, em monocamada de células da tuba uterina. No sétimo dia, uma amostragem de zigotos foi submetida à hipotonizaçäo e coloraçäo, para avaliar o número de células. Os resultados da taxa de fecundaçäo, da clivagem e do número de células foram 92,96, 59,86 e 87,16; 85,39, 61,43 e 104,00; 79,37, 60,00 e 131,16, para ovócitos maturados pelos tratamentos I, II, III, respectivamente. A análise pelo qui quadrado da taxa de fecundaçäo e de clivados e a análise de variância do número de células näo apresentaram diferenças (P>0,05) entre tratamentos. Os resultados demonstram que näo há diferenças na taxa de fecundaçäo e capacidade de desenvolvimento dos ovócitos, quando a fecundaçäo é realizada com 18 horas no caso de maturaçäo sem células e com 24 horas quando a maturaçäo é realizada em co-cultivo de células da granulosa

Tipos morfológicos de ovócitos bovinos / Morphological types of bovine oocytes

Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro para estudar o tipo de envoltório celular em 14.583 ovócitos. Após aspiraçäo dos folículos, os complexos "cumulus-ovócitos" foram lavados e classificados da seguinte maneira: 1-corona radiata intacta e mais de três camadas compactas de células do cumulus oophorus; 2-uma a três camadas de células envolvendo o ovócito; 3-parcialmente recoberto por células da corona radiata e o cumulus oophorus; 4-células do cumulus oophorus apresentando expansäo; 5-desnudo; 6-ovócitos apresentando características que näo configuram em nenhuma classificaçäo anteriormente citada. As freqüências encontradas foram 69,3; 7,8; 6,7; 11,1; 4,7 e 0,3 por cento, para as categorias 1, 2, 3, 4, 5 e 6 respectivamente. Ficou caracterizada a importância de estudos de maturaçäo e fecundaçäo in vitro, com ovócitos apresentando o cumulus compacto, devido à sua elevada incidência em ovários de vacas

Técnica simplificada para desnudamento rápido de ovócitos bovinos / A simplified technic for rapid denudation of bovine oocytes

Foram utilizados ovócitos com cumulus compactos cultivados in vitro, oriundos de 1.854 ovários de vacas abatidas em matadouro. O cultivo foi realizado em meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento), acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml). As amostras foram obtidas em 0, 12, 18, 24 e 30 horas de cultivo, para o procedimento da desnudaçäo. O desnudamento foi realizado através de pipeta automática de 100µl utilizando ponteira com medidas específicas e placa escavada de vidro com capacidade de 1,5ml, onde eram colocados os ovócitos com 1 ml de Meio Talpes. Os movimentos de aspiraçöes e injeçöes do meio com os ovócitos possibilitaram o desnudamento após um período máximo de cinco minutos. Foram desnudados 3.450 ovócitos, sendo 690 para cada tempo de cultivo. Raramente foi verificada a permanência de ovócito näo desnudado totalmente após o uso da técnica

Técnica para avaliaçäo do estádio de maturaçäo nuclear de ovócitos bovinos cultivados in vitro / Technic for evaluating nuclear maturation of bovine oocytes cultured in vitro

Foi desenvolvida uma técnica para avaliaçäo do estádio de maturaçäo nuclear de ovócitos de bovinos, que permitisse clara visualizaçäo das configuraçöes cromossômicas. Após aspiraçäo de folículos oriundos de ovários de vacas abatidas em matadouro, os complexos "cumulus-ovócitos" foram lavados e em seguida classificados em categorias quanto ao tipo de envoltório celular. Ovócitos com cumulus compacto foram cultivados em diferentes tempos, em meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (2µg/ml), soro inativado de vaca em estro (10 por cento) e células de granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml). Foram analisadas 1.371 lâminas confeccionadas de ovócitos cultivados por 0, 12, 18, 24 e 30 horas. A técnica permitiu clara visualizaçäo dos bivalentes na metáfase I e dos monovalentes na metáfase II, mantendo ainda a integridade da configuraçäo cromossômica típica na anáfase I e metáfase II, apesar da hipotonizaçäo realizada. Além disso, manteve a disposiçäo dos cromossomos do primeiro corpúsculo polar, quando presente