Purificación del factor IX recombinante expresado en leche de cerdas transgénicas / Purification of recombinant factor IX expressed in milk of transgenic sows

Se purificó a partir de la leche de cerdas transgénicas, factor IX recombinante, y se obtuvieron rendimientos entre 1 a 2 g de esta proteína por litro, lo que resulta una nueva vía para la obtención de este producto con una alta eficiencia, ya que su expresión es 1 000 veces superior a la del factor IX plasmático humano. Mediante la combinación de 2 pasos cromatográficos: intercambio iónico en DEAE-Shephadex A-50 y cromatografía de afinidad con heparina, se realizó la purificación del factor IX, con esta leche como material de partida. Se estudiaron diferentes métodos para la eliminación de las caseínas, contaminante principal del proceso, y se escogió finalmente la ultracentrifugación, por las numerosas ventajas que presenta con respecto a la precipitación isoeléctrica y la precipitación por sales. El factor IX puede ser purificado de la leche transgénica con una alta pureza utilizando métodos cromatográficos que no usan inmunoafinidad y son finalmente escalables en la producción industrial, lo cual proporciona nuevas perspectivas para el tratamiento de la hemofilia B mediante la preparación de posibles formulaciones orales.

Recombinant factor IX was purified from milk of transgenic sows, and yieldings between 1 and 2 g of this protein per liter were obtained. This is a new way to get this product with a high efficiency, since its expression is 1 000 times higher than of the human plasmatic factor IX. By combining 2 chromatographic steps (ion exchange in DEAE-Shephadex A-50 and affinity chromatography with heparin), the factor IX was purified, with this milk as a starting material. Different methods were studied to eliminate caseins, the main pollutant of the process, and ultracentrifugation was selected due to its numerous advantages over the isoelectric precipitation and salt precipitation. Factor IX may be purified from transgenic milk with an elevated purity by chromatographic methods that do not use immunoaffinity and are finally scalable in industrial production, which provides new perspectives for treating hemophilia B by preparing new oral formulations.

Determinación del anticoagulante lúpico: experiencia de 4 años / Determination of the lupus anticoagulant: a 4-year experience

Se realizó un estudio retrospectivo de los resultados de la determinación del anticoagulante lúpico (AL) realizadas en el período comprendido entre julio del 2000 y julio del 2004 en el laboratorio de hemostasis del Instituto de Hematología e Inmunología. En este período se le realizó la determinación del AL a 380 muestras, el 86 por ciento de las cuales pertenecían a pacientes del sexo femenino, la positividad global fue del 7,3 por ciento, el tiempo de veneno de víbora de Russell diluido fue la prueba que detectó más casos positivos (50 por ciento), pero se evidenció la necesidad de realizar más de una prueba para detectar todos los casos positivos. La prevalencia del AL se comportó de la siguiente forma: en el lupus eritematoso sistémico fue del 17,8 por ciento, en la anemia hemolítica autoinmune del 21 por ciento, en la púrpura trombocitopénica idiopática del 7,6 por ciento, en un grupo de misceláneas que incluyó principalmente artralgias, vasculitis, síndrome de Evan- Fischer, tiempo parcial de tromboplastina prolongado, sangramientos e infecciones a repetición fue del 3,5 por ciento, en pacientes con trombosis fue del 7,6 por ciento y en pacientes con abortos a repetición y/o pérdidas fetales del 4,6 por ciento; resulta de gran importancia su determinación en enfermedades autoinmunes, ya que el 39 por ciento de los casos positivos pertenecían a este grupo, aunque su positividad fue baja en el grupo de mujeres con abortos y/o pérdidas fetales a repetición y en pacientes con trombosis

Anticoagulante lúpico en enfermedades autoinmunes / Lupus anticoagulant in autoimmune diseases

El tromboembolismo venoso es una complicación reconocida en diferentes enfermedades autoinmunes. Se ha establecido que la detección del anticoagulante lúpico (AL) y posiblemente los anticuerpos anticardiolipina (AAC) tipo Ig G en título alto y medio, ayuden a identificar pacientes con riesgo de trombosis. Estudiamos el AL en 81 pacientes con enfermedades autoinmunes: 25 pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), 28 pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), 15 con anemia hemolítica autoinmune (AHAI) y 13 que se incluyeron en el grupo de otras enfermedades, que comprendían vasculitis cutánea de pequeños vasos, enfermedad mixta del tejido conectivo, artritis reumatoidea y esclerodermia. El AL se encontró en el 19,7 por ciento del total de los estudiados: 16 por ciento en pacientes con LES, 21,4 por ciento en pacientes con PTI y 40 por ciento en la AHAI. En el grupo de otras enfermedades no se halló ningún paciente con el AL positivo. El 56,3 por ciento de los pacientes con AL positivo presentaron alguna manifestación atribuible al síndrome antifosfolípido (SAF)

Enfermedad de von Willebrand adquirida: aspectos generales / Acquired von WillebrandÆs disease: general aspects

La enfermedad de von Willebrand adquirida es una enfermedad hemorrágica poco común. Aproximadamente en la mitad de los casos se asocia con enfermedades linfoproliferativas y también se ha relacionado con trastornos mieloproliferativos, neoplasias, enfermedades inmunológicas, cardiovasculares y otras condiciones clínicas. Debe sospecharse en todos los pacientes que presenten una diátesis hemorrágica de aparición tardía sin historia personal o familiar de coagulopatía; los síntomas clínicos son similares a los de la enfermedad de von Willebrand congénita. Esta enfermedad parece tener una etiología multifactorial; en la mayoría de los pacientes afectados el factor von Willebrand (FvW) se sintetiza normalmente, sin embargo, es rápidamente removido del plasma a través de diferentes mecanismos, cuyo resultado final común es la disminución de los niveles circulantes de este factor. Los ensayos clásicos de laboratorio incluyen la exploración de la hemostasia primaria y las pruebas específicas para la determinación de la actividad antigénica y funcional del FvW. El tratamiento va dirigido en 2 direcciones principales: corregir episodios de sangrado agudo y tratar la enfermedad subyacente y condiciones asociadas

Aspectos del aseguramiento de la calidad en los laboratorios de hemostasia / Quality assurance in hemostasia laboratories

En concepto de control de la calidad se ha expandido en los últimos años y actualmente se está sustituyendo por el término de garantía de la calidad como concepto más abarcador, que comprende todo el proceso de la actividad relacionada con el laboratorio clínico, desde que se genera la petición analítica hasta que el resultado llega a manos del solicitante. Estas prácticas se requieren para la acreditación de los laboratorios clínicos y servicios de transfusión, en la que la palabra clave es la documentación de los sistemas de aseguramiento de la calidad. En la hemostasia, la etapa pre-analítica es una etapa fundamental; de ella depende en gran medida el resultado final, la preparación adecuada de controles, así como el uso de calibradores para la determinación de la actividad de los factores individuales y la detección de inhibidores. La determinación del tiempo de protrombina (TP), de la relación normalizada internacional y del tiempo parcial de tromboplastina activado (TPTA), son determinaciones usuales en el control externo de la calidad (CEC), mientras que la determinación de la concentración de fibrinógeno, factor VIII coagulante, otros factores e inhibidores fisiológicos de la coagulación, se incluyen de forma más esporádica. Actualmente se están llevando a cabo programas internacionales para la estandarización de varias pruebas de laboratorio. Para implementar la estandarización de las pruebas y materiales usados en la hemostasia, varias instituciones han decidido dirigir sus esfuerzos para lograr sistemas comunes de referencia.

Estado actual del mecanismo de la coagulación sanguínea / Present state of the blood coagulation mechanism

Actualmente se acepta de forma categórica que el evento iniciador principal de la coagulación sanguínea es la exposición del factor tisular (FT), lo cual da lugar a la formación del complejo factor VIIa/FT que activa a los factores IX y X en la superficie de las células que expresan el FT, y se forman las primeras cantidades de trombina. Esta trombina ejerce múltiples funciones en el mecanismo hemostático, pero es insuficiente para lograr una hemostasia eficaz, lo cual solo se logra con el ensamblaje del complejo protrombinasa en la superficie plaquetaria. El descubrimiento en la década de los 90 de la activación del factor XI por la trombina, permite explicar las observaciones clínicas en los pacientes con deficiencia de los factores de la fase de contacto de la coagulación: estos no presentan complicaciones hemorrágicas (excepto el déficit de factor XI). El descubrimiento realizado recientemente de la activación de la precalicreína y del factor XI por una cisteín proteasa localizada en la superficie de las células endoteliales fundamentalmente hace sospechar un nuevo papel de estas proteínas in vivo. La coagulación sanguínea es un proceso estrechamente regulado, y por su significación fisiológica es importante la regulación de la vía del factor tisular que limita las cantidades iniciales de trombina, así como la regulación de las proteasas formadas durante el mecanismo de la coagulación por la antitrombina III y de los cofactores activados por el sistema de la proteína C.

At present, it is categorically accepted that the exposure of the tissue factor (TF) is the main initiator event of blood coagulation, which brings about the formation of the factor VIIa/TF complex that activates the factors IX and X on the surfaces of the cells expressing the TF and, thus, the first amounts of thrombin are formed. This thrombin has multiple functions in the haemostatic mechanism, but it is insufficient to attain an efficient haemostasis, which is only possible with the assembly of the prothrombinase complex on the platelet surface. The discovery in the 1990’s of the activation of factor XI by thrombin allows to explain the clinical observations made in those patients with deficiency of the coagulation contact phase factors: these patients do not present hemorrhagic complications (excepting the deficit of factor XI). The recent discovery of the activation of precallicrein and factor XI by a cysteine protease located mainly on the surface of the endothelial cells make us think about a new role of these proteins in vivo. Blood coagulation is a closely regulated process and due to its physiological significance it is important the regulation of the tissue factor pathway that limits the initial amounts of thrombin, as well as the regulation of the proteases formed during the mechanism of coagulation by antithrombin III and of the cofactors activated by the protein C system.

Sensibilidad del tiempo parcial de tromboplastina activado a la deficiencia de factores VIII y IX Y a la heparina / Sensitivity of the activated partial thromboplastin time to the deficiency of factors VIII and IX and heparin

Se reevaluó el rango de referencia del tiempo parcial de tromboplastina activada (TPTA). Se obtuvo un rango de referencia de 29 a 40 seg. con una media (X) de 34,01 seg. Con nuestro sistema de reactivos se alcanzaron resultados aceptables en cuanto a la sensibilidad a diferentes niveles de actividad de los factores VIII y IX, se logró una alta correlación en ambos casos (r2 = 0,9842 y 0,9846, respectivamente) cuando se relacionó el TPTa con los diferentes niveles de actividad de los factores VIII y IX. Se obtuvo una respuesta lineal en el intervalo de actividad de heparina utilizado normalmente en la terapia (0,2 a 0,5 UI/mL) y se alcanó una buena respuesta a altas concentraciones de heparina (0,8 UI/mL), expresada por un valor finito del TPTa. Se corroboró la necesidad de alargar el tiempo de incubación con el activador a 10 min para mejorar la sensibilidad del ensayo a la heparina.

The reference range of the activated partial thromboplastin time (APTT) was reevaluated. A reference range from 29 to 40 seconds with a mean (X) of 34.01 sec. was obtained. By using our system of reagents, acceptable results were obtained as regards the sensitivity to different levels of activity of factors VIII and IX. A high correlation was attained in both cases (r2 = 0.9842 and 0.9846, respectively) when the APTT was associated with the different levels of activity of factors VIII and IX. A linear response was obtained in the interval of heparin activity commonly used in therapy (0.2 to 0.5 UI/mL) and a good response was attained at high concentrations of heparin (0.8 UI/mL) expressed by a finite value of APTT. The need to extend the incubation time with the activator to 10 min. to improve the sensitivity of the test to heparin was corroborated.

Efecto agregante plaquetario de 2 citolisinas: sti y stii purificadas de la anémona marina Stichodactyla helianthus / Platelet aggregation effect of 2 cytolysins: sti and stii purified from the sea anemone Stichodactyla helianthus

Las citolisinas Sticholysina I (St I) y Sticholysina II (St II) inducen la agregación plaquetaria en el plasma rico en plaquetas en el rango de concentraciones ensayadas (0,5 a 10 µg/mL). Para ambas citolisinas se obtienen porcentajes de agregación plaquetaria superiores al 90 porciento con menos del 50 porciento de lisis celular. La agregación plaquetaria se mantiene elevada aún cuando la lisis celular disminuye a menos del 20 porciento. El EDTA 2 mM/L y el verapamilo 100 mM/L inhiben significativamente la agregación inducida por StI, lo que evidencia que el calcio extracelular tiene una función importante en este proceso y probablemente esta citolisina tiene una función similar a la de un ionóforo de calcio. Con StII no se obtuvo inhibición significativa de la agregación en presencia de EDTA y verapamilo. La agregación inducida por ambas citolisinas no está influida por el aumento del AMPc intracelular y es independiente de la formación de tromboxano A2 en la plaqueta

Descripción de un inmunoensayo enzimático que reconoce anticuerpos anti-factor viii/von Willebrand obtenidos a partir de hibridomas múridos / Description of an enzime immunoassay that recognizes anti-factor viii/von Willebrand antibodies obtained from murine hybridomas

Se describe un inmunoensayo enzimático (ELISA) que detecta anticuerpos anti-Factor-VIII/von Willebrand (FVIII/vW), con una relación de enlace > 5, que permite reconocer dichos anticuerpos tempranamente en los cultivos de hibridomas múridos. Para la adsorción de las placas del inmunoensayo se utilizaron preparados semipurificados de FVIII/vW obtenidos en Cuba. Se inmunizaron ratones Balb/c con la finalidad de generar los anticuerpos monoclonales detectados por este ELISA. Se obtuvo un clon con crecimiento estable y varios subclones positivos por el ELISA con actividad biológica específica de anticuerpos inhibidores de FVIII

El síndrome antifosfolípido / The antiphospholipid syndrome

Los anticuerpos antifosfolípidos (AAP) son un grupo de autoanticuerpos con afinidades variables por complejos de proteínas y fosfolípidos. Los anticuerpos anticardiolipina (ACAs) son detectados usualmente por técnicas de ELISA, mientras que el anticoagulante lúpico es medido como una actividad que prolonga las reacciones de la coagulación dependientes de fosfolípidos. Se han descrito en enfermedades autoinmunes, infecciosas, asociados a drogas, en neoplasias y en individuos sanos y se han asociado con fenómenos trombóticos venosos y arteriales, abortos a repetición y trombocitopenia, constituyendo lo que se denomina "síndrome antifosfolípido" (SAF)

Trastornos de la hemostasia en la leucemia promielocitica aguda

Se estudio la hemostasia en 20 pacientes con leucemia promielocitica aguda (LPA), antes del tratamiento, durante la induccion de la remision y despues de obtener la remision completa (RC). Se detecto coagulacion intravascular diseminada (CID) en 14 casos, el 71 por ciento de ellos en el momento del diagnostico. Se encontro una mayor mortalidad en las primeras semanas de evolucion, frecuencia de episodios hemorragicas, asi como un menor porcentaje de RC en enfermos con CID. El tratamiento con heparina se utilizo en 8 pacientes, con buenos resultados en 6 de ellos (75 por ciento), en 5 de estos casos se uso conjuntamente el acido retinoico en trans (ART). En el 83,3 por ciento de los pacientes con CID tratados con ART se logro la correccion de la coagulopatia entre 1 y 2 semanas. En el 10 por ciento de los casos se encontraron evidencias clinicas de trombosis. Los resultados obtenidos demuestran que la CID ocupa un lugar central en los trastornos de la hemostasia en la LPA, tiene una repercusion importante sobre el desarrollo clinico de la enfermedad y puede lograrse su rapida eliminacion con el tratamiento con ART en la mayoria de los pacientes

Variantes moleculares de los factores de la coagulación dependientes de la vitamina K / Molecular variantts of vitamin K-dependient coagulation factors

Se presenta una revisión de algunas características bioquímicas y funcionales de los factores de la coagulación que dependen de la vitamina K para su síntesis, así como de las variantes moleculares descritas para cada factor, las que se caracterizan por tener una actividad funcional disminuída o ausente, con una actividad antigénica generalmente normal. El estudio de algunas de estas variantes ha permitido conocer con exactitud el defecto estructural que ellas presentan y también conocer mejor la estructura de estas proteínas, sus interacciones y la función que realizan en el mecanismo hemostático

Historia natural de los inhibidores del factor VIII en pacientes con hemofilia A / Natural history of factor Viii inhibitors in patients with hemophilia A

Durante 3 años se estudiaron las características epidemiológicas, clínicas y de laboratorio de los inhibidores de factor VIII: C (F VIII:C) en 88 hemofílicos A. Al inicio del estudio, la incidencia fue del 13,6 %. En algunos pacientes se detectó el inhibidor en una sola ocasión a pesar del tratamiento ulterior con factor VIII. La incidencia de los inhibidores que aparecieron durante el estudio fue del 10.6 %. Se desarrollaron fundamentalmente en hemofílicos seriamente afectados; el nivel de F VIII:C no estuvo relacionado con la tasa alcanzada por el inhibidor y en más de la mitad de los pacientes aparecieron antes de los 10 años de edad. La conversión de un bajo respondedor a un altorespondedor por el uso de terapéuticas sustitutiva con factor VIII. Se demostró en un paciente. La desaparición del inhibidor fue de 12 meses como promedio, y no ocurrió en la mayoría de los enfermos alto respondedores. No se observó un mayor número de episodios hemorrágicos después de la aparición del inhibidor y éste estuvo presente en el 75 % de los pacientes fallecidos durante el estudio

Producción y calibración de tromboplastina / Production and calibration of thromboplastin

Se preparó un lote de tromboplastina mediante un método de extracción salino el cual ha mostrado ser estable al menos durante una semana después de reconstituido a 4 -C. Para la determianción del índice de sensibilidad internacional (ISI) se utilizó una preparación internacional de referencia (PIR) BCT/441 de origen humanom y una tromboplastina comercial de conejo de isi conocido, calibrada contra la preparación BCR RBT/79. El ISI obtenido para nuestra preparación de tromboplastina fue de 1,17. La disponibilidad de esta tromboplastina permitirá un mejor control de la terapia anticoagulante y la implantación del sistema relación normalizada internacional (INR) en nuestro país

Anticoagulante lúpico: su relación con la trombosis / Lupoid anticoagulant: its relation to thrombosis

El anticoagulante lúpico representa un grupo de anticuerpos del tipo IgG o IgM, frecuentemente asociado al lupus eritematoso sistémico, aunque más recientemente se ha encontrado en otras enfermedades y relacionado con el uso de algunas drogas. Se plantea que estos anticuerpos están dirigidos contra fosfolípidos aniónicos que tan importante son en la coagulación sanguínea; sin embargo se ha comunicado una alta frecuencia de trombosis, tanto venosa como arterial, en pacientes con anticoagulante lúpico. La patogénesis de la trombosis en esos pacientes no es aún conocida, aunque se plantea que la alteración de las propiedades antitrombogénicas del endotelio vascular podría jugar un papel clave en el desarrollo de la trombosis

Mecanismos actuales de la iniciación de la coagulación sanguínea / Present mechanisms of the initiation of blood coagulation

Algunos hechos no explicables mediante la teoría de la coagulación existente hasta el momento, así como evidencias clínicas y experimentales, han llevado a un grupo de investigadores a plantear que el complejo tromboplastina-factor VII es el "disparador" más importante de la coagulación in vivo, que la principal secuencia de reacciones de activación de las proenzimas es: factor VII-factor X-factor II y que hay un reforzamiento constituido por las reacciones factor VII-factor IX-factor X, por lo que los factores VII y IX pueden ser considerados factores de una vía alternativa de activación del factor X: Se plantea que esta vía es regulada a través de la cantidad de tromboplastina liberada después de producirse una lesión. Por otra parte, se ha informado la existencia de un inhibidor plasmático al que se le denominó inhibidor de la vía extrínseca que requiere del factor X para su acción. No menos importantes son los mecanismos de regulacióm ya conocidos como son los mecanismos de retroalimentación positiva por la trombina y la acción de la C y la antitrombina III en la coagulación

Antitrombina: III. Algunas consideraciones generales / Antithrombin: III. Some general considerations

Se plantea que la ATIII es el principal inhibidor fisiológico de la trombina en el plasma, además inhibe a los factores Xa, IXa, XIa, XIIa, a plasmina y la calicreína plasmática. Se informa que la ATIII es una glicoproteína de peso molecular entre 58000 y 67000 daltons, compuesta por una cadena polipeptídica. Se indica que la capacidad inhibitoria de la ATIII es acelerada en presencia de heparina. Se plantea que existen varias hipótesis acerca del mecanismo de reacción sustentadas por hechos experimentales. Se señala que hay una correlación entre los niveles reducidos de ATIII y la predisposición a manifestaciones trombóticas, lo que es una evidencia de la importancia de su función regulatoria en el mecanismo hemostático