Anticuerpos anti-FVIII: su evaluación por citometría de flujo / Anti FVIII antibodies: evaluation by flow cytometry

En este trabajo se describe un sistema para evaluar y caracterizar los anticuerpos anti-FVIII en pacientes con Hemofilia A Severa (HAS) que reciben el Factor como tratamiento de sustitución. Consiste en el empleo combinado de microesferas y Citometria de Flujo (CF). El rFVIII fue acoplado a microesferas de 2 µm de diámetro (m-FVIII) las cuales se incubaron con diluciones de plasma o suero de pacientes con (n=13) o sin (n=17) inhibidor, pacientes en Tratamiento Inmunotolerante (TIT)(n=5) y dadores normales (N) (n=12). Los anticuerpos se revelaron con anti-lgG humana, anti-lgG1, anti-lgG2, anti-IgG3 o anti-lgG4 biotiniladas, seguido por streptavidina-ficoeritrina. Se registraron los valores de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM). Microesferas sin FVIII (m-Control) se utilizaron como control. El resultado se expresó como índice: (IFM de m-FVIII/IFM de m-Control) multiplicado por la inversa de la dilución de máxima respuesta. Se determinó el porcentaje de contribución de cada subclase de IgG. Los resultados presentaron un 86 por ciento de concordancia con la prueba de Bethesda y un 80 por ciento con ELISA. El método fue útil para el seguimiento de los pacientes durante el TIT. La IgG4 prevaleció en pacientes con alto título y al comienzo del TIT. La CF es fácil y rápida y requiere sólo 200 µl de muestra.

In this study, a Flow Cytometry (FC) system is described for detecting and characterizing antibodies (inhibitors) to Factor VIII (FVIII) in Severe Haemophilia A (SHA) patients following FVIII infusion. A combination of microspheres and Flow Cytometry (FC) was employed. First, rFVIII was coupled to microspheres of 2 µm of diameter (m-FVIII). Then, they were reacted with dilutions of plasma or serum of patients with (n=13) or without (n=17) inhibitors. Five patients receiving Immunotolerant Treatment (ITI) and 12 normal donors were included. Microspheres without rFVIII were used as control (m-Control). Captured anti-FVIII antibodies were detected using biotinylated anti-Human IgG, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 followed by streptavidin-phycoerythrin. FC analysis was performed recording Mean Fluorescence Intensity (MFI). Results were given as an Index: the highest MFI ratio between m-FVIII and m-Control multiplied by the inverse of the corresponding plasma dilution. The contribution of each IgG subclass was expressed as percentage. FC results had 86 per cent and 80 per cent of coincidence with the Bethesda method and ELISA respectively. The test was useful to measure anti-FVIII antibodies during the ITI. IgG4 was the prevalent IgG subclass in patients with high level of inhibitors and previously to ITI. FC was easy, fast and requires only 200 µl of sample.

Ausencia del receptor CD16b en neutrófilos / Neutrophils without CD16b receptors

Se presentan dos pacientes (mujeres de 41 y 15 años de edad) con ausencia del receptor para el fragmento Fc de IgG, CD16b en neutrófilos (fenotipo "null"). El caso 1 fue referida al laboratorio con diagnóstico de hemoglobinuria nocturna paroxística y el caso 2) con diagnóstico presuntivo de neutropenia inmune. En ambos casos se comprobó por citometría de flujo la ausencia de expresión de CD16b, sin deficiencias en la expresión de otras moléculas del sistema de alloantígenos propios de neutrófilos ni defectos en el anclaje a membrana por glicosil fosfatidil inositol (GPI). Las manifestaciones clínicas en ambas pacientes: anemia en el caso 1 y leucopenia en el caso 2 no pueden ser atribuidas exclusivamente a la carencia de CD16b, ya que otros receptores para Fc de IgG (CD32 y CD64) podrían suplir la función de CD16b. Sin embargo, es importante tener en cuenta esta rara deficiencia (b y neutropenia isoinmune natal transitoria en niños nacidos de mujeres con fenotipo "null".

Occurrence of the rare CD16b deficiency ("null" phenotype) in neutrophils from two female patients (41 and 15 years old) is reported. The first case was referred with a diagnosis of anemia related to paroxistic nocturnal hemoglobinuria and the second case, with presumptive diagnosis of immune neutropenia. In both cases, absence of CD16b expression was determined by flow cytometry without deficiencies of other neutrophil alloantigens or defects of membrane anchorage through glycosil phosphatydil inositol (GPI) linkage. Clinical manifestations in both patients could not be attributed exclusively to the absence of CD16b, as other receptors for the IgG Fc fragment (CD32 and CD64) could compensate this deficiency that occurs in < 1% of the caucasic population. Nevertheless, it is important to take this rare deficiency into account in order to prevent isoantibody formation after eventual blood transfusions, or transient neonatal immune neutropenia in children born to women with the "null" phenotype.

Interleukin-2 restores natural killer activity inhibited by sera from HIV + Hemophilic patients

Natural killer (NK) activity is impaired in patients with positive serology for the human immunodeficiency virus (HIV). We previously found an inhibitory effect of sera from hemophilic (He) HIV+ patients on normal NK activity. In the present study, we have further characterized this effect by studying its reversibility, temperature and time incubation dependence. Since interleukin 2 (IL-2) is able to enhance NK levels, we analized the capacity of this lymphokine to reverse the effect of He HIV+ sera. We found that when IL-2 activation of NK activity occurred simultaneously or after HIV+ serum-treatment, a significant restoration of NK function was observed. In contrast, preincubation with IL-2 did not affect the inhibitory effect exerted by HIV+ sera.

Aumento de CD4 en monocitos de pacientes con Hemofilia VIH positivos / Increased CD4 in monocytes from HIV+ Hemophilia patients

El sistema monocito macrofágico (M/M) juega un papel central en la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la expresión del antígeno CD4 sobre la superficie del M/M es un factor clave para la entrada del VIH a células susceptibles. En este trabajo evaluamos los niveles del receptor CD4 en monocitos de pacientes con hemofilia (He) infectados o no con el VIH (He-VIH+). Se estudiaron treinta pacientes He-VIH+, cuatro pacientes seronegativos (He-VIH-) y veinte dadores normales voluntarios. La evaluación fenotípica de los monocitos fue realizada por citometría de flujo a partir de sangre periférica teñida con anticuerpos monoclonales anti CD45, CD3, CD4 y CD14. Se encontró que el porcentaje de monocitos CD4+ estaba incrementado en todos los grupos de pacientes (incluyendo He-VIH-), pero fue más alto en pacientes sintomáticos He-VIH+. Además el valor más frecuente de intensidad de fluorescencia para CD4 de la población de monocitos de estos pacientes, estaba desplazado hacia zonas de mayor intensidad respecto de los individuos normales. Esto indicaría una expresión incrementada del número de moléculas CD4 sobre la membrana celular de los monocitos. Las características de esta células en los pacientes He-VIH+, podrían favorecer la persistencia y la diseminación viral.

Apoptosis linfocitaria y evolución clínica en pacientes con hemofilia hiv positivos / Apoptossis and clinical evolution in HIV positive hemophilic patients

Se han postulado diversas hipótesis para explicar los defectos cuali y cuantitativos de los linfocitos T CD4+, en los pacientes HIV+. Ultimamente se ha sugerido que la apoptosis podría estar involucrada en la depleción linfocitaria observada, ya sea por acción del virus o por acción secundaria a la estimulación antigénica. El objetivo de nuestro trabajo fue determinar el IA en HeHIV+ sintomáticos. Se estudiaron 32 HeHIV+ agrupados según la clasificación del CDC en HI, IVA y IVCI. Se evaluaron morfológicamente los linfocitos periféricos en cultivos de 48 horas estimulados o no con anti-CD3. La apoptosis se valoró por medio de coloración, con naranja acridina y bromuro fr etidio. En todos los grupos de HeHIV+ el IA se encontraba muy elevado en los cultivos sin estimular, con respecto a los normales (p<0,001); tambiéen eran significativamente mayor en los HeHIV+ del grupo CDC IVCI con respecto al grupo CDC HI. Por los resultados obtenidos se comprobaría que en los HeHIV+ sintomáticos la estimulacín in vitro produce apoptosis en un porcentaje elevado de los linfocitos circulantes. El IA sería de utilidad en el seguimiento de los pacientes por su relación con el cuadro clínico

Evaluación de la respuesta a aloantigenos en pacientes con hemofilia seropositivos y seronegativos para el virus de la inmunodeficiencia humana / Evaluation of the alloantigen response in patients with hemophilia seropositive and seronegative for the immunodeficiency viruses

Se evaluó la respuesta a aloantígenos de los pacientes con hemofilia (He) por medio del cultivo mixto de linfocitos unidireccional (CML). También se analizó la capacidad de las células mononucleares periféricas (CMN) para generar linfocitos T citotóxicos contra antígenos no propios del complejo mayor de histocompatibilidad. Los resultados obtenidos muestran que la respuesta proliferativa frente a aloantígenos de los He seropositivos para el virus de la inmunodeficiencia adquirida (VIH) está significativamente disminuida. Por otra parte, los He VIH+ con linfoadenopatías persistentes (LAS) son capaces de generar respuesta citotóxica normal o elevada. En cambio, se observó una función efectora menor en He VIH+ asintomáticos (SPC). Parecería que el CML es un procedimiento útil para distinguir los efectos de la inmunidad mediada por células asociados a la infección por el VIH. Además, se podría sugerir que el defecto que presentan los He VIH- y los VIH+ SPC para generar respuesta citotóxica normal, se debería a una regulación negativa generada como una consecuencia de los aloantígenos inoculados con los concentrados antihemofílicos. Los He VIH+ LAS perderían esta regulación con la progresión de la enfermedad

Alteraciones inmunológicas en pacientes con púrpura trombocitopenica idiopática crónica / Immunological changes in patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura

En este trabajo se valoró la inmunidad mediada por células y los niveles de inmunocomplejos circulantes en 30 pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática crónica (PTI). Se hallaron diversas alteraciones inmunológicas: los pacientes con PTI tenían valores relativos de linfocitos B aumentados y disminuidos los de linfocitos T. La transformación blástica inducida por PHA estaba disminuida al igual que la función supresora T-T inespecífica inducida por Con A. Se rencontró una correlación directa entre los recuentos plaquetarios y la función supresora (r=0,61, p<0,01). El nivel de IgG asociada a la membrana plaquetaria era más alto en aquellos pacientes con marcada depresión de la actividad supresora. Estos resultados no estaban relacionados a la edad y sexo de los pacientes ni al tratamiento o evaluación de la enfermedad

Urticaria vasculítica: angioedema adquirido y enfermedad tiroidea autoinmune / Vasculitic urticaria: acquired angioedema and autoimmune thyroid disease

Se estudia un caso de urticaria vasculítica y deficiente adquirida del inhibidor de C1 en una paciente con historia personal y familiar de enfermedad de Graves que presenta poliquistosis ovárica. La deficiencia no es confirmada en sus familiares, es transitoria al igual que la disminución de C4 y presencia de complejos inmunes circulantes y se halla FAN + 1/250. Se cree que ambos cuadros se vinculan a la alteración inmune de la paciente, ya que la función tiroidea estaba normalizada al comenzar los brotes, y se menciona la probable acción beneficiosa de la indometacina y el antiestrógeno en la remisión clínica de ambas afecciones sin descartar la remisión espontánea