Identificação de novos antagonistas para receptores purinérgicos P2 / Identification of new antagonists for P2 purinergic receptors

Os receptores purinérgicos P2 são receptores expressos na membrana plasmática de diversos tipos celulares humanos, nos quais exercem importantes funções fisiológicas . Eles são divididos em duas classes, de acordo com a estrutura apresentad a . A classe P2X comp reende os subtipos de receptores ionotrópicos que são ativados fisiologicamente pelo ATP. Dentre os receptores P2X, o P2X7 destaca se por suas funções associadas à dor e à inflamação. Já a classe P2Y compreende os subtipos de receptores metabotrópicos, os quais são ativados por diferentes nucleotídeos extracelulares. Nes s a última classe, o subtipo P2Y2 destaca se p elos seus papeis desempenhados na inflamação e no câncer, enquanto o P 2Y4 se sobressai pela escassez de informações acerca de suas funções fisiol ógicas devido a limitações de caráter farmacológico . Apesar de serem considerados importantes alvos terapêuticos , ainda não existe m fármacos com atuação sobre ess es receptores que sejam aprovados para uso clínico , o que encoraja a busca por novas moléculas com atividade antagonista. Ness e contexto, o objetivo des t e estudo foi identificar novos antagonistas para receptores P2 (P2X7, P2Y2 e P2Y4) e averiguar se eles exercem algum papel n a atenuação da dor e inflamação Na primeira part e dess e trabalho foi identificada a atividade antagonista d o extrato galhos de Joannesia princeps Vell. após a realização de uma mini campanha de triagem. Utilizando a técnica de mensuração de cálcio intracelular, foi demonstrado que esse extrato foi capaz de inibir a mobiliza ção de cálcio induzida por UTP de forma concentração dependente, sendo que esse efeito não foi provocado por citotoxicidade ou fenômeno quenching. (AU)

Além disso, esse extrato também foi capaz de inibir parcialmente a mobilização de cálcio induzida por UDP . Co m isso , os resultados sugerem uma possível seletividade quanto à ação antagonista desse extrato sobre os receptores P2Y ativados por nucleotídeos derivados da uridina. Enquanto isso, na segunda parte do trabalho foi identificada a atividade antagonista d a molécula CS 15 sobre o receptor P2X7 durante a realização de uma mini campanha de triagem . A molécula CS 15 , um triterpeno isolado da planta Clusia studartiana C. M. Vieira & Gomes da Silva foi capaz de inibir a captação do corante YO PRO 1 em ensaios de permeabilização celular de forma concentração dependente e apresentou um IC 50 na faixa de nanomolar. A demais , ess a molécula não demonstrou toxicidade in vitro e ainda foi capaz de aliviar os sintomas de nocicepção em modelo experimental animal. Coletivamen te, os resultados apontam para a descoberta de novos antagonistas para receptores P2 de origem natural , os quais podem contribuir no futuro para o escasso campo da terapia associada aos receptores purinérgicos. (AU)

Padronização da triagem de alto desempenho de antagonistas para receptores purinérgicos ativados por UTP a partir da mensuração de cálcio intracelular / Standardization of the screening of high performance antagonists For receivers purinergic activated by UTP from Measurement of calcium intracellular

Os receptores purinérgicos são proteínas expressas na membrana plasmática de diversos tiposcelulares e são ativadas por purinas e pirimidinas extracelulares. Eles são classificados emreceptores P1 e P2, de acordo com o tipo de ligante fisiológico, entretanto, os P2R são aindasubdivididos nas classes: P2XR, que abrange os subtipos ionotrópicos e P2YR, que agrupa ossubtipos acoplados à proteína G. Dentre os P2YR, os subtipos P2Y2 e P2Y4 vem sendoamplamente estudados em virtude de suas funções sobre diversos sistemas biológicos. Umavez ativados pelo UTP, estes receptores promovem a ativação e inibição de canais iônicos,controlam o fluxo de íons através da membrana, induzem um aumento de cálcio intracelular,além de estimular a proliferação celular. Em vista disso, muitos grupos de pesquisa já vemestudando o P2Y2 e o P2Y4 como alvos terapêuticos para o tratamento de diversas doenças,tais como fibrose cística, doença do olho seco, doença de Alzheimer, entre outras. Entretanto,a escassez de moléculas com propriedade antagonista seletiva sobre estes receptores dificultao avanço da caracterização de novos papéis funcionais associados a eles, e neste contexto, osprodutos naturais podem atuar como uma importante fonte para a descoberta de compostosque apresentem a característica almejada. Por isso, o objetivo deste trabalho foi padronizaruma metodologia de mensuração de cálcio intracelular induzido pelo UTP em células dalinhagem de macrófagos murinos J774.G8 e realizar a triagem de extratos oriundos deprodutos naturais a fim de identificar compostos com atividade antagonista sobre o P2Y2R eo P2Y4R. Para isso, foi padronizado um protocolo de carregamento celular com o indicadorde cálcio Fluo-4AM com posterior leitura dos sinais de cálcio no FlexStation III em células J774.G8...

The purinergic receptors are proteins expressed in plasma membrane of many cell types thatare activated by extracellular purines and pyrimidines. They are classified in P1 and P2receptors, according to physiological ligand. However, the P2R are further subdivided in twoclasses: P2X for ionotropic subtypes and P2Y for G-protein coupled ones. Among P2YR, theP2Y2 and P2Y4 subtypes has been widely studied due to their functions in many biologicalsystems. Once activated by UTP, these receptors promote the activation and inhibition of ionchannels, control the flow of ions through the membrane, induce an increase of intracellularcalcium and stimulate the cell proliferation. In view of this, many research groups have beenstudying the P2Y2 and P2Y4 as therapeutic targets for the treatment of several diseases likeCystic Fibrosis, Dry Eye Disease, Alzheimer, among others. However, the lack of moleculeswith selective antagonist property on these receptors difficults the advancement ofcharacterization of new functional roles associated with them, and in this context, naturalproducts may act as an important source for the discovery of compounds that present thisdesired feature. Therefore, the aim of this study was to standardize a methodology formeasurement of intracellular calcium mobilization induced by UTP in a murine macrophagecell line J774.G8 and perform the screening of extracts derived from natural products in orderto identify compounds with antagonist activity on the P2Y2R and P2Y4R. For this, it wasstandardized a protocol of cell labeling with calcium indicator Fluo-4AM in J774.G8 cellswith subsequent detection of calcium signals in FlexStation III...