Estudo comparativo da inibição da proliferação de fibroblastos in vitro na conjuntiva utilizando mitomicina C e ciclofosfamida / Comparative study of inhibition of fibroblasts proliferation in vitro in the conjunctiva using mitomycin and ciclophosphamide

RESUMO Objetivo: Avaliar a inibição da proliferação de fibroblastos in vitro das conjuntivas obtidas através de exérese de pterígios de pacientes utilizando mitomicina C (MMC) e ciclofosfamida (CF). Métodos: Os pterígios foram retirados de 7 pacientes e submetidos a cultivo celular. Após o cultivo, 3 fragmentos de dimensões iguais deste material foram colhidos de áreas adjacentes do pterígio removido de cada paciente. Eles foram randomicamente selecionados de tal forma que: um fragmento de cada paciente foi exposto: ao meio de cultura (grupo controle), a MMC e a CF por igual período de tempo nas concentrações de 0,4 mg/ml e 10 mg/ml respectivamente. Após este período realizou-se a contagem celular de fibroblastos destes 3 grupos. Cada grupo continha 7 fragmentos. Resultados: Com a utilização da MMC tivemos uma taxa de 95% da inibição da proliferação dos fibroblastos, enquanto com a CF 100%. Conclusões: Ambas as drogas apresentaram elevada taxa da inibição da proliferação de fibroblastos, porém a CF apresentou inibição maior que a MMC.

Abstract Objective: To evaluate the inhibition of fibroblast proliferation in vitro of conjunctiva obtained by excision of pterygium from patients using mitomycin (MMC) and cyclophosphamide (CF). Methods: Pterygiums were removed from 7 patients and subjected to cell culture. After cell cultivation, 3 fragments of equal dimensions of these tissues were collected from adjacent areas of each patient removed pterygium. They were randomly selected in such a way that one fragment of each patient was exposed to: the culture medium (group control), to MMC and to CF for an equal period of time at concentrations of 0,4 mg/dl and 10 mg/dl respectively. After this period, the fibroblast cell count of these groups were performed. Each group had seven fragments. Results: With the use of MMC we had a 95% rate of inhibition of fibroblast proliferation, while with CF 100%. Conclusion: Both drugs showed a high rate of inhibition of fibroblast proliferation, but CF showed greater inhibition than MMC.

Efeitos de algumas drogas sobre a proliferação de fibroblastos de pterígio primário in vitro / Effects of some drugs in the fibroblastic proliferation in primary pterygium in vitro

OBJETIVO: Este estudo tem por objetivo observar a inibição da proliferação celular in vitro em pterígios primários utilizando mitomicina C, ciclofosfamida e metotrexato. MÉTODOS: Os pterígios foram retirados de 7 pacientes com idade entre 30 e 60 anos e foram submetidos à cultura de suas células epiteliais. Foi então verificado o efeito de drogas sobre as células: ciclofosfamida, metotrexato e mitomicina. As células foram observadas por 5 dias ao microscópio para avaliar a proliferação celular e os experimentos foram repetidos 5 vezes. RESULTADOS: Quando a mitomicina foi utilizada observou-se importante inibição da proliferação celular. Quando a ciclofosfamida foi utilizada houve também inibição do crescimento, 50% após 24 horas de cultura após a exposição da droga aumentando nos dias subsequentes. Nenhum efeito foi observado quando o metotrexato foi utilizado. CONCLUSÃO: Os efeitos de inibição da proliferação celular pela mitomicina C já eram esperados, porém a ciclofosfamida também apresentou-se bastante eficaz. A ação inibitória da ciclofosfamida sobre a proliferação fibroblástica in vitro nos leva a acreditar que ela possa ser usada para prevenir a recorrência do pterígio depois da excisão. Entretanto, testes em animais e posteriormente em humanos se fazem necessários para se chegar a essa conclusão.

OBJECTIVE: This study aims at observing the inhibition of cell proliferation in primary pterygium by the use in vitro of mitomicyn C, cyclophosphamide, methotrexate. METHODS: Pterigyum was removed from seven pacients between 30 and 60 years and were submitted to culture of epithelial cells. Later the effect of drugs was tested on the cells: cyclophsphamide, methotrexate, mitomicyn. The cells were observed for five days under the microscope to assess cellular proliferation, and the experiments were repeated five times RESULTS: When mitomicyn was used, a marked inhibition of cellular proliferation was observed. When cyclophosphamide was used there also was inhibition of cellular proliferation, 50% within 24 hs of the culture exposition to the drug increasing in the following days CONCLUSION: The inhibition effects in the cellular proliferation by the use of mitomicyn C was already expected, but the use of cyclophosphamide was also very effective. The cyclophsphamide inhibitory action on fibroblastic proliferation in vitro lead us to believe that it may be used to prevent pterygium recurrence after incision. However, tests in animals and later in humans are necessary.

Aspectos histológicos do ovário de coelhas após criopreservação / Histological aspects of rabbit ovarian tissue after cryopreservation

OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50 por cento (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80 por cento (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30 por cento das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSAO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

Cultura de embriöes até o estágio de blastocisto: comparaçäo entre o uso de meios seqüenciais e de co-cultura / Embryo culture to blastocyst stage: comparison using sequential medium and coculture

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário entre o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilizaçäo in-vitro. Metade das pacientes teve seus embriöes cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriöes foram transferidos no dia 5 pós-fertilizaçäo, após avaliaçäo morfológica, verificando-se a taxa de blastulaçäo. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9 por cento e 14 por cento com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0 por cento das pacientes engravidaram com taxa de implantaçäo de 18,9 por cento. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantaçäo foram 28,9 por cento e 14,9, por cento, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5 por cento de taxa de gravidez e 63,0 por cento de implantaçäo. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantaçäo foram de 57,1 e 76,0 por cento, respectivamente. Conclusäo: näo houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantaçäo nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantaçäo e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que näo apenas as condiçöes de cultura influenciam as taxas de implantaçäo e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Avaliaçäo do desenvolvimento de embriões bovinos pós-biópsia: um modelo para treinamento / Evaluation of the post-biopsy development of bovine embryos: proposal of a training model

Objetivo: montar um protocolo animal para estudo e treinamento em biópsia embrionária. Métodos: ovários de vaca obtidos em abatedouro eram transportados ao laboratório onde os oócitos aspirados eram maturados. Posteriormente eram submetidos à fertilizaçäo in vitro. No dia 5 pós fertitizaçäo, os embriões eram biopsiados, com a abertura da zona pelúcida realizada mediante lâmina de corte ajustada ao microscópio óptico. Após abertura da zona pelúcida 1 ou 2 blastômeros eram removidos dos embriões. Após a biópsia, os embriões permaneciam em co-cultivo por mais três dias. Ao final deste tempo, o desenvolvimento dos embriões era avaliado e comparado ao do grupo controle por meio de estudo morfológico e contagem do número de células, usando coloraçäo específica para núcleos. Resultados: dos 57 embriões biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto (70,2 por cento) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5 por cento). No grupo controle obtiveram-se 42 blastocistos (73,7 por cento) e, destes, 11 chegaram a "hatching" (26,2 por cento). Após contagem do número de células, observou-se que näo houve diferença estatisticamente significante entre os 2 grupos. Conclusäo: podemos verificar por meio dos resultados que o protocolo proposto foi tecnicamente viável, além de fornecer bom número de embriões, pela facilidade de obtençäo de oócitos bovinos, podendo ser adotado para treinamento

Co-cultura de embriões humanos em células vero e transferência em fase de blastocisto / Human embryo coculture in vero cells and blastocyst stage transfer

Objetivos: determinar se o dia da transferência ou o estágio em que o embriäo é transferido interferem nas taxas de gravidez e implantaçäo. Métodos: cento e sete pacientes tiveram seus oócitos aspirados e submetidos à fertilizaçäo in vitro. Os embriões foram co-cultivados em células Vero e transferidos no dia 3 ou dia 5 pós-fertilizaçäo, após avaliaçäo morfológica. Resultados: a taxa de implantaçäo dos embriões transferidos no dia 5 foi significativamente maior que quando os embriões eram transferidos no dia 3, mas as taxas de gravidez näo variaram. Observou-se uma diferença significativa nas taxas de gravidez quando se comparou o estágio em que o embriäo era transferido, obtendo-se 70,6 por cento de gravidez quando se transferiram blastocistos expandidos e 20 por cento e 10,5 por cento quando eram transferidos blastocistos iniciais ou mórulas, respectivamente. Conclusões: as taxas de implantaçäo e gravidez säo significativamente aumentadas quando se transferem embriões em estágio de blastocisto expandido, mas os meios e condições de cultura de que dispomos no momento ainda säo insuficientes para nos fornecer uma taxa satisfatória de embriões neste estágio