Inactivación de la dihidrolipoamida deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi por fenotiazinas en presencia de citocromo c y peróxido de hidrógeno: efectos de los antioxidantes / Trypanosoma cruzi dihydrolipoamide dehydrogenase is inactivated by phenothiazines in the presence of cytochrome c and hydrogen peroxide: effects of antioxidants

El citocromo c catalizó la oxidación de las fenotiazinas (FTZ) en presencia de peróxido de hidrógeno. La formación del radical catiónico de promazina (PZ+.) se demostró por espectrofo-tometría y por su conversión a promazina sulfóxido La dihidrolipoamida deshidrogenasa (LADH) del Trypanosoma cruzi es inhibida irreversiblemente por el sistema citocromo c/H2O2 complementado con fenotiazinas. La inactivación de la LADH del parásito varía según la estructura de las FTZ, el tiempo de incubación del sistema pro-oxidante con la LADH, y la presencia de un antioxidante supresor de radicales FTZ+. Entre las 12 FTZ ensayadas, la promazina (PZ), tioridazina (TRDZ) y trimeprazina (TMPZ) fueron las más efectivas produciendo inactivaciones de 82 por ciento,76 por ciento y 72 por ciento, respectivamente, a los 90 min de incubación. El efecto de PZ (con grupo alquilamino en la posición N 10) disminuyó por modificación de su estructura en la posición 2 (efecto inactivante de PZ > cloropromazina (CPZ) > propionilpromazina (PPZ) > trifluopromazina (TFPZ) o en la posición 10 ( efecto inactivante de PZ > TMPZ > prometazina (PMTZ).El efecto de las FTZ con sustituyente piperidinil en N 10 dependió del grupo de la posición 2 ( SCH3, en TRDZ de mayor efecto; CN, en propericiazina (PCYZ), la de menor efecto entre las FTZ estudiadas). Parece que la presencia del sustituyente piperazinil en posición N 10 no tiene función importante en el efecto inactivante de las FTZ, el cual dependió de la estructura del grupo en la posición 2. El efecto de los compuestos con Cl en posición 2 (CPZ, procloroperazina (PCP), perfenazina (PFZ)) fue mayor que el obtenido con los compuestos CF3 (TFPZ, trifluoroperazina (TFP), flufenazina (FFZ), e independiente de la estructura del sustituyente N 10.El efecto de las FTZ sobre la LADH de T. cruzi depende, por lo menos en parte, de la estabilidad de los radicales FTZ+. generados por la actividad peroxidasa. La LADH T c, en comparación con la LADH de mamífero...

Cytochrome c catalyzed the oxidation of phenothiazines (PTZ) in the presence of hydrogen peroxide. The transient formation of the promazine radical cation (PZ+.) has been demonstrated by light absorption measurements as well as by its conversión to promazine sulfoxide. Trypanosoma cruzi dihydrolipoamide dehydrogenase (LADH T c) was irreversibly inhibited by treatment with cytochrome c (cyt c)/H2O2 system supplemented with PTZ. LADH T c inactivation depended on a) The PTZ structure b) Time of incubación with the complete oxidant system c) The presence of an antioxidant that intercept free radicals. PZ, thioridazine (TRDZ) and trimeprazine (TMPZ), were the most effective systems out of twelve PTZ studied, with inactivation values of 82, 76 and 72%, respectively, after 90 min of incubation. LADH T c inactivation by PZ (with alkylamine substituent at N 10 position) decreased by its structural modification at 2 position (inactivation PZ > chlorpromazine (CPZ) > propionylpromazine (PPZ)>trifluopromazine (TFPZ)) or at N 10 position (inactivation PZ > TMPZ > promethazine (PMTZ)) PTZ activity with piperidinyl substituent at N10 position depended on the group at 2 position (TRDZ, with thiomethyl group, has high inactivating effect on LADH T c; propericyazine (PCYZ), with cyano group, is much less active). Apparently, piperazinyl substituent at the N10 position on the phenothiazine have not an important function in the compound's inactivating effect on LADH T c. The effect of PTZ with Cl at 2 position (CPZ, prochlorperazine (PCP), perphenazine (PFZ)) was higher than the effect of compounds with CF3 in the same position (TFPZ,trifluoperazine (TFP),fluphenazine (FFZ) ) independent on the structure of substituents at N10 position. Production of PTZ+. radicals was essential for LADH T c inactivation and this effect depended on the stability of these free radicals. Comparision of inactivation values for LADH T c and mammalian LADH demonstrated...

Diferentes efectos de radicales catiónicos de las fenotiazinas sobre la dihidrolipoamida deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi y de miocardio / Different effects on phenothiazine cation radicals on Trypanosoma cruzi and myocardial dihydrolipoamide dehydrogenase

Las fenotiazinas (FTZs) son agentes terapéuticos importantes especialmente como neurolépticos, no obstante sus efectos tóxicos secundarios. Algunas FTZs tienen también acción tripanocida sobre el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, in vitro e in vivo. Esa actividad se atribuye a la molecula neutra aunque el tratamiento de las FTZs con peroxidasas produce los radicales catiónicos correspondientes (PTZ+À). En este trabajo demostramos que el tratamiento de varias FTZs con sistemas peroxidasa/H2O2' genera los radicales FTZ+À, potentes inhibidores de enzimas como la dihidrolipoamida deshidrogenasa (LADH) del T. cruzi. La inactivación de esas enzimas dependió de la actividad de la peroxidasa, la estructura de la FTZ y del tiempo de incubación del sistema inactivante con la enzima. Con el sistema mieloperoxidasa (MPO)/H2O2 con la mieloperoxidasa de leucocitos humanos, la Promazina (PZ), la Trimeprazina (TMPZ), La Tioridazina (TRDZ), la Prometazina (PMTZ) y la Clorpromazina (CPZ) resultaron inactivadores eficaces de la LADH, a la concentración 100 µM de FTZ, después de 30 minutos de incubación del sistema con la enzima. La Propionilpromazina resultó mucho menos activa y la Trifluopromazina (TFPZ) inactiva, de acuerdo a la estructura del sustituyente en la posición 2 de la mólecula de FTZ. Efectos similares se obtuvieron con el sistema Mb/H2O2', con mioglobina de músculo estriado como peroxidasa aunque con el mismo la influencia de la estructura de la FTZ fue menos notable que con la MPO. La acción de la peroxidasa en la inactivación de la LADH fue confirmada con la peroxidasa de rábano, que fue activa con todas las FTZs ensayadas. Resultados similares se obtuvieron con la LADH de miocardio, si bien con esta enzima el efecto de los sistemas peroxidasa/H2O2/FTZ fue significativamente menor (cerca de 50 por ciento) que con la enzima de T. cruzi. La formación de los radicales catiónicos de las FTZ se demostró con el sistema HRP/H2O2/TRDZ. El tiol N-acetilcisteína (NAC) inhibió completamente esa formación. Por consiguiente, tioles como el glutatión reducido, NAC, el Captopril y la Penicilamina previnieron la inactivación de las LADHs por el sistema MPO/H2O2/TRDZ. Los resultados presentados constituyen una contribución a la farmacología de las FTZ.

Effect of the lipophilic o-naphthoquinone CG 10-248 on rat liver mitochondria structure and function

CG 10-248 (3,4-dihydro-2,2 dimethyl-9-chloro-2H-naphtho[1,2b]pyran-5,6-dione), a beta-lapachone analogue, modified the ultrastructure of rat liver mitochondria in vitro, in the absence of added oxidizable substrates. The condensed mitochondrial state was replaced by the orthodox or swollen state to a significant degree. The number of modified mitochondria depended on incubation time and quinone concentration, in the 25-100 microM range. Under the same experimental conditions, mitochondrial respiration was uncoupled as indicated by the increase in the rate of succinate oxidation by controlled mitochondria in metabolic state "4" (not in state "3"), and by the activation of latent F0F1-ATP synthase. Taking into account structural similarities, the results reported here may be valid for other o-naphthoquinones, such as beta-lapachone.

Citotoxicidad de la ß-Lapachona: una O-Naftoquinona con posibles usos terapéuticos / Citotoxicity of ß-Lapachone: an O-naphthoquinone with possible therapeutic uses

La ß-lapachona (ß-lap) es una o-naftoquinona extraída de la madera del lapacho. Las observaciones iniciales mostraron su acción inhibidora del crecimiento del sarcoma de Yoshida, del carcinosarcoma de Walker 256 y del Trypanosoma cruzi. La ß-lap genera productos reactivos del oxígeno (EROS: anión superóxido, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno) a los que inicialmente se atribuyó su citotoxicidad. ß-lap resultó un potente inhibidor de la síntesis de ADN en T. cruzi, de las topoisomerasas I y II de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de diferentes orígenes, enzimas responsables de la reparación y mantenimiento de la estructura del ADN. Se investigó la citotoxicidad de ß-lap en células de cáncer epidermoide de laringe, melanoma, cáncer de ovario, de mama, de próstata, de pulmón, adenocarcinoma de colon y diferentes formas de leucemia aportando un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la acción de ß-lap y su relación con los procesos de apoptosis y necrosis. Entre esos mecanismos se comprobó la activación de la calpaina, proteasa cuya actividad depende de tioles, seguida por la activación de quinasas (c-JUN), caspasas y nucleasas, que finalmente degradan al ADN y a las proteínas celulares. Una reacción importante para la actividad de la ß-lap es su reducción enzimática, especialmente por la diaforasa y la NAD(P)H-quinona reductasa, que inician la producción de EROS. La acción de ß-lap sobre células tumorales resultaría de la inhibición directa de enzimas como las topoisomerasas, PARP y el factor TNF, sumada a la acción de radicales libres generados por la ß-lap. Los efectos citostáticos de ß-lap han abierto interesantes perspectivas para la quimioterapia del cáncer.

Effect of dyskinetoplastic agents on ultrastructure and oxidative phosphorylation in Crithidia fasciculata

Ethidium bromide (EB) is an intercalating agent which binds specifically to the kinetoplast (mitochondrial) DNA (kDNA) of trypanosomatids. Accordingly, EB inhibits DNA replication, thus inducing dyskinetoplasty. Since in eukariotic organisms mitochondrial DNA encodes the genetic information for cytochromes b, aa3 and F0F1 ATPase, it seemed of interest to establish whether a similar effect occurs in Crithidia fasciculata, a trypanosomatid used for assay of potential trypanocidal drugs. Culturing of C. fasciculata in the presence of EB inhibited growth and induced dyskinetoplasty, as confirmed by electron microscopy. The kinetoplast of EB-cultured crithidia lost its characteristic arc shape, it was misplaced in the cell cytoplasm its matrix structure and membrane differentiation were specifically modified. Dyskinetoplasty decreased crithidia respiration and oxidative phosphorylation, as indicated by the lower ATP level, ATP/ADP ratio and adenylate energy charge. The interference of EB with kinetoplastic constituents synthesis was confirmed by the lack of action of EB on crithidia in the stationary phase of growth, that ruled out direct inhibition of oxidative phosphorylation enzymes. The lipophilic o-naphthoquinone beta-lapachone produced structural alterations in kinetoplast membranes, that correlated with inhibition of oxidative phosphorylation. These latter effects involved free radicals since they were prevented by free radical scavengers.

Citotoxidad de la beta lapachona: una o-naftoquinona con posibles usos terapeuticos / Cytotoxicity of beta-lapachone, an naphthoquinone with possible therapeutic use

La Beta-lapachona (Beta-lap) es una o-naftoquinona extraída de la madera del lapacho. Las observaciones iniciales mostraron su acción inhibidora del crecimiento del sarcoma de Yoshida y del carcinosarcoma de Walker 256. La Beta-lap genera productos reactivos del oxígeno (ROS: anión superóxido, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno) a los que inicialmente se atribuyó su citotoxicidad. Beta-Lap resultó un potente inhibidor de la síntesis de ADN en T. cruzi, de la topoisomerasas I y II y de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de diferentes orígenes, enzimas responsables de la conservación del ADN. Se investigó la citotoxicidad de Beta-lap en células de cáncer epidermoide de laringe, melanoma, cáncer de ovario, de mama, de próstata, de pulmón, adenocarcinoma de colon y leucemia, aportando un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la acción de Beta-lap y su relación con los procesos de apoptosis y de necrosis. Se comprobó la activación de la calpaina, proteasa cuya actividad depende de tioles, seguida por la activación de quinasas (c-JUN NH2 -quinasa terminal), caspasas y nucleasas, enzimas que degradan al ADN y a las proteínas celulares. Una reacción importante para la actividad de la Beta-lap es su reducción, especialmente por la diaforasa y la NAD(P)H-quinona reductasa, que inician la producción de ROS. La acción de Beta-lap sobre células tumorales resultaría de la inhibición directa de enzimas como las topoisomerasas, PARP y el factor TNF, sumada a la acción de radicales libres. Los efectos citostáticos de ß-lap han abierto interesantes perspectivas para la quimioterapia del cáncer.

Inactivación de la tripanotiona reductasa del Trypanosoma Cruzi por radicales libres catiónicos de fenotiazinas / Inactivation of Trypanosoma Cruzi, trypanothione reductase by peroxidase/H202/phenothiazine systems

La incubación de la tripanotiona reductasa (TR) de Trypanosoma cruzi con sistemas peroxidasa/H2O2/fenotiazina (FTZ) produjo la inhibición irreversible (inactivación) de TR. El grado de inactivación dependió de: (a) el tiempo de incubación de TR con el sistema peroxidasa/H2O2/FTZ; (b) la naturaleza de la peroxidasa y (c) la estructura de la FTZ. Con las FTZ más activas, la cinética de la inactivación presentó una fase inicial no mayor de 10 minutos, durante la cual TR perdió cerca del 90 por ciento de su actividad. Esa fase fue seguida por otra más lenta, y después de 30 minutos de incubación, TR fue completamente inactiva. Se ensayaron tres peroxidasas, a saber: la peroxidasa de rábano (HRP), la mieloperoxidasa de leucocitos (MPO) y la mioglobina modificada (Mb). En condiciones experimentales comparables, la actividad de las peroxidasas como componentes de los sistemas ensayados decreció en el orden indicado. Con el sistema HRP/H2O2/FTZ, la inactivación final de TR fue de 95-100 por ciento con Tioridazina (TRDZ), Promazina (PZ), Trimeprazina (TMPZ), Proclorpromazina (PCP), Propionilpromazina (PPZ) y Perfenazina (PFZ), todas en concentración 10 µM. Con los sistemas MPO/H2O2/FTZ, las FTZ más activas fueron PZ, TRDZ, TMPZ, PCP y Clorpromazina (CPZ). En iguales condiciones, los sistemas Mb/H2O2/FTZ también inactivaron a TR, utilizando PZ, TMPZ, TRDZ y CPZ. Grupos alquilamino, piperazinilo o piperidilo en la posición 10 (el N) y átomos o grupos -CI, -CF3, -SCH3, COCH2CH3 y -CN en la posición C2 de FTZ afectaron significativamente la actividad de las FTZs. El glutatión (GSH) previno la inactivación de TR por los sistemas HRP/H2O2/PZ y MPO/H2O2/PZ. Los sistemas HRP/H2O2/FTZ y MPO/H2O2/FTZ generaron los radicales catiónicos FTZú+, con estabilidad limitada por su conversión en fenotiazina-sulfoxidos (FTZ-SO), aparentemente inactivos sobre TR. El GSH reaccionó con los radicales catiónicos, regenerando las FTZ originales, lo que concuerda con la protección de TR por GSH frente a los sistemas peroxidasa/H2O2/PZ y, por lo tanto, con la intervención de los radicales catiónicos en la inactivación de TR por los mismos sistemas.

Quimioterapia de la enfermedad de Chagas / The chemotherapy of Chagas disease

Se han ensayado numerosos fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) pero, hasta ahora, ninguno ha resultado absolutamente eficaz. Esos fármacos se pueden clasificar en los siguientes grupos: a) tripanocidas eficaces in vitro y en el modelo murino, de uso clínico aceptado (Nifurtimox, Benznidazole); b) tripanocidas eficaces in vitro y en el modelo murino, de uso clínico discutible (azoles, Anfotercina B Allopurinol, Allopurinol ribosidos, primaquina); c) tripanocidas activos sobre el T. cruzi en el modelo murino y también in vitro: Alquilisofosfolípidos, 5-amino-imidazol-4-carboxamidas, bisbenciliquinolinas, fenotiazinas, Gossipol e, inhibidores de la cruzipaína, d) tripanocidas in vitro: sin otra actividad documentada, actinomicina D, acridinas, Cristal Violeta (violeta de genciana), diterpenos (de Mikania sp), N, N'-dimetil-2-propen-1-1mina, epoxidienetiol carbamato, fenazina metolsulfato, fenoxi-fenoxil fármacos, guanil hidrazonas, olivacina, pridinazolato betainas, Proadifen, quelantes de Fe, o-naftoquinonas (Beta-lapachona), quinoides (miconidina, tingenona), sesquiterpeno (de Lychophora sp); sesquiterpeno lactonas, tetrahidrocarbazoles, DL-alpha-trifluorometilarginina, trifenilmetanos (colorantes). El Nifurtimox y el Benznidazole se caracterizan por (a) ser efectivos en la fase aguda de la infección chagásica pero no en la fase crónica; (b) la relación entre su acción y las cepas de T. cruzi infectante, que pueden ser susceptibles o resistentes al fármaco; (c) su acción genotóxica en bacterias; (d) producir efectos adversos ("no deseados") en el paciente chagásico y producir daño celular en diferentes órganos de animales de experimentación (hígado, testículo, adrenales, placenta, etc.); (e) generar radicales libres del oxígeno, que aparentemente determinan la acción tripanocida y los tóxicos. Los azoles inhiben la enzima esterol-C14 delta-demetilasa, inhibición que previne la síntesis del ergosterol en tripanosomas. En el modelo murino, los azoles reducen la parasitemia y prolongan la sobrevida de los ratones infectados, pero no curan al paciente chagásico. El Allopurinol y sus derivados inhiben la síntesis de nucleótidos púrinicos y de DNA en el T. cruzi; suprimen la parasitemia y prolongan la sobrevida de los ratones infectados pero su efecto puede ser tranitorio y no curan la infección humana. Los inhibidores de la cruzipaína son eficaces en las fases aguda y crónica de la infección chagásica....

Efectos fisiopatologicos del oxido nitrico y su relacion con el estres oxidativo / Psysiopathologic effects of nitric oxide and its relationship with oxidative stress

El óxido nítrico (NO.) es producido por la oxidación de la arginina a citrulina, una reacción catalizada por las enzimas óxido nítrico sintasas (NOS). Se acepta que esa reacción es la única capaz de producir NO en los sistemas biológicos, en condiciones normales o patológicas. El NO regula diferentes funciones en células y tejidos de mamíferos, tales como: (a) el control de la presión sanguínea; (b) la relajación del tono del músculo liso arterial; (c) la agregación y adhesión plaquetaria; (d) la neurotransmisión; (e) la función neuro-endócrina. El NO. también participa en la destrucción de microorganismos patógenos y de células tumorales por leucocitos y macrófagos. La producción de anión superóxido (O2-) y NO. ha sido asociada al desarrollo de muchas patologías, pero recientemente se ha comprobado que la interacción de esas moléculas genera el ión peroxintrito (ONOO-), lo que constituye un importante mecanismo fisiopatológico pues, como oxidante, el ONOO- ataca un gran número de blancos biológicos. Por su influencia sobre la producción de ONOO-, el balance entre la producción de NO y O2- es crítico en la etiología de procesos como hipertensión, ateroesclerosis, enfermedades neurodegenerativas, infecciones virales, daño por isquemia-reperfusión y cáncer.

0-Naftoquinonas lipofílicas como tripanocidas y citostáticos potenciales / Lipophilic o-naphthoquinones as trypanocidal and cytostatic potentials

0-Naftoquinonas, como la ß-lapachona, que fueran antes propuestas como agentes antichagásicos, han resultado potentes inhibidores del crecimiento de células tumorales humanas, lo que ha renovado el interés por esas quinonas. Por ello, se revisan ahora los mecanismos de la citotoxicidad de varias o-naftoquinonas y moléculas similares, representadas por la ß-lapachona y las mansononas. La mayoría de esas quinonas son potentes inhibidores del crecimiento de Trypanosoma cruzi. Crithidia fasciculata y Leptomonas seymouri, a concentraciones del orden de 1.0-10 µM. Su acción implica la operación de reacciones redox. La inicial de reducción de la quinona a quinol (hidroquinona), es seguida por la oxidación del quinol por oxígeno molecular. La oxidación del quinol genera radicales semi-quinona, superóxico y peróxido de hidrógeno capaces de generar el radical hidroxilo, notable por su citotoxicidad. Como consecuencia de esas reacciones se produce un "daño oxidativo", que en los protozoarios estudiados se manifiesta por la disminución del ATP celular como resultado de la inhibición de la fosforilación oxidativa. También se produce disminución de la síntesis de DNA, RNA y proteínas celulares. Al mismo tiempo, las quinonas aumentan la degradación fisiológica de las mismas moléculas. Resultados similares se obtuvieron con naftoquinona-iminas. Los grupos carbonilos vecinos y el anillo tirano son estructuras esenciales para la acción citotóxica de las quinonas. Estos efectos se discuten en relación a posibles usos farmacológicos de las naftoquinonas lipofílicas.

Oxygen radicals and the chemotherapy of Chagas' disease: an overview

Current knowledge on the role of oxygen radicals in the development of chemotherapy for Chagas' disease is reviewed. This includes: a) a brief description of the disease and its prevalence in the endemic area; b) applicability and toxicity of nifurtimox and benznidazole; c) the production of oxygen radicals by nitrocompounds, specially by nifurtimox; d) the action of nifurtimox and benzidazole on DNA, RNA and protein synthesis and degradation in Trypanosoma cruzi, including nuclear DNA and kinetoplast DNA cleavage and repair; e) nifurtimox reduction by lipoamide dehydrogenase; J) the role of T cruzi trypanothione system; g) the chemical and biological consequences of replacing the tetrahydrothiazine group of nifurtimox by unsaturated nitrogen heterocycles; h) the electronic properties of the new compounds, in relation to their capability for nitroanion radical production and trypanocidal action in vitro (QSAR) and in vivo; i) evidence for the possible role of oxygen radicals in the action of nifurtimox on T. cruzi and the human host. It is concluded that the chemotherapy of Chagas'disease remains an unsolved problem and, therefore, the search for new drugs must continue.