Avaliação dos efeitos modulatórios da hematopoese no envelhecimento: Papel das células tronco mesenquimais medulares / Evaluation of the modulatory effects of hematopoiesis during aging: Role of bone marrow mesenchymal stem cells

O envelhecimento é um processo fisiológico que traz consigo uma série de alterações no organismo que se estendem até o nível molecular. Diante disto, este é um processo complexo que afeta diversos tecidos, sendo um deles o hematopoético, local onde, através de interações da Célula Tronco Hematopoética (CTH) com o ambiente ao seu redor, incluindo a Célula Tronco Mesenquimal (CTM), ocorre a hematopoese. Embora já sejam descritas na literatura algumas alterações na medula óssea consequentes do envelhecimento, os mecanismos por trás de tais mudanças permanecem elusivas, principalmente no âmbito das interações celulares ocorrentes na medula óssea. Portanto, este trabalho buscou investigar como o envelhecimento afeta a regulação hematopoética no contexto de sua relação com as CTM medulares. Para esta pesquisa, foram utilizados camundongos machos isogênicos da linhagem C57BL/6, dividindoos em grupos conforme sua idade: jovens (3 ­ 5 meses) e idosos (18 ­ 19 meses). Foi realizada a caracterização do modelo através de aspectos físicos como consumo proteico, variação de peso, entre outros, seguido de avaliação bioquímica e hematológica. Adicionalmente, foram coletadas células medulares e, posteriormente, realizado o isolamento das CTMs. Para estudar a relação destas células com a hematopoese, foram realizados ensaios in vitro utilizando a linhagem celular leucêmica C1498 (TIB-49™, ATCC®) mantidas em contato com o sobrenadante das CTMs isoladas. Quanto aos parâmetros bioquímicos, os animais idosos apresentaram menores níveis de albumina, aspartato alanina transferase (ALT) e de triglicerídeos quando comparados aos animais jovens. Contrariamente, os animais idosos apresentaram um maior nível de colesterol. Na avaliação hematológica, foi constatado pelo hemograma que os animais idosos apresentaram valores comparáveis aos animais jovens, todavia, o mielograma mostrou menor celularidade geral, seguido de menor número de células da linhagem eritroide e maior número de precursores granulocíticos. Através da imunofenotipagem, foi revelado um maior número de CTHs e de precursores grânulosmonocíticos na medula de animais idosos quando comparado aos jovens, e uma menor frequência de progenitores linfoides. Na imunofenotipagem de sangue periférico de animais idosos houve uma redução no número de linfócitos B e de eritrócitos, e aumento na população de células natural killers. Na imunofenotipagem de CTMs, o marcador CD73 apresentou menor expressão nos animais idosos. Avaliando o secretoma destas células estromais, foram encontrados no sobrenadante de CTMs de animais idosos aumentos significativos nas concentrações de CXCL12 e SCF e redução de IL-11. No âmbito molecular, as CTMs de animais idosos apresentaram aumento na expressão de Akt1, Nos e Ppar-γ, e redução na expressão de Csf3 e Cdh2. Adicionalmente, quando comparado a ação das CTMs de animais idosos em relação as CTMs de animais jovens, observou-se que CTMs de animais idosos foram capazes de aumentar a expressão de Sox2, Pou5f1 e Nanog e diminuir a expressão de Cdkn1a de células da linhagem C1498. O sobrenadante de CTMs de animais idosos também resultou na maior proliferação e migração de células da linhagem C1498. Portanto, levando em consideração a importância das CTMs sobre a regulação do sistema hematopoético, pode-se concluir que, no envelhecimento, as CTMs criam um ambiente propício para a proliferação celular no qual a manutenção da pluripotência é estimulada, o que pode acarretar em uma desregulação do sítio hematopoético quando habitado por células malignas

Aging is a physiological process in which occurs a series of alterations in an organism that extend to a molecular level. It is a complex process that affects various tissues, one of them being the bone marrow, wherethrough the interactions of the hematopoietic stem cell (CTH) with its surrounding environment, including with the mesenchymal stem cell (CTM), hematopoiesis takes place. Although some aging-associated alterations in the bone marrow can be found described in the literature, the mechanisms behind said changes remain elusive, especially when regarding the cellular interactions present inside the bone marrow. Therefore, this research aimed to investigate how aging affects the regulation of hematopoiesis in the context of its interactions with bone marrow-derived CTMs. For this investigation, male isogenic C57BL/6 mice were used as animal models. These were separated in two groups according to their age: young (3 ­ 5 months) and aged (18 ­ 19 months). The animal models were characterized by their physical properties such as protein intake and weight variation, followed by biochemical and hematological evaluation. Bone marrow cells were obtained and identified through immunophenotyping, thus isolating different cell populations, including the CTMs. To study the relationship between these cells and hematopoiesis, in vitro assays were conducted utilizing the leukemic cell lineage C1498 (TIB-49™, ATCC®) maintained in contact with the supernatant of isolated CTMs. By their biochemical profile, aged mice showed lower levels of albumin, alanine-aspartate transferase (ALT) and triglycerides compared to the young group. In contrast, aged mice had a higher cholesterol level. Hematological evaluation by total blood count showed similar results between the two groups, however, the myelogram revealed that the aged animals had lower cellularity, with less frequent cells from the erythroid lineage, with an increase in granulocytic precursors. Through immunophenotyping, it was also revealed that aged mice have higher numbers of hematopoietic stem cells, while also being noted a reduced population of lymphoid progenitors. An increase in the granulomonocytic progenitors was also found. Immunophenotyping peripheral blood cells of aged mice revealed reduced numbers of B lymphocytes and erythrocytes, and an increased natural killer cell population. Additionally, the cell surface marker CD73 was found to be less expressed in aged mice CTMs. The secretome of these stromal cells obtained from aged mice showed higher levels of CXCL12 and SCF, and lower levels of IL-11when compared to the young counterparts. At a molecular level, CTMs obtained from aged mice expressed more Akt1, Nos and Ppar-γ, while the expression of Csf3 and Cdh2 was reduced. Additionally, when comparing the effects of aged mice CTMs with young mice CTMs, it was observed that the first expressed were capable of increasing the expression of Sox2, Pou5f1 and Nanog, while decreasing Cdkn1a expression in the C1498 cell lineage. The supernatant obtained from aged mice also favored the proliferation and cell migration of the C1498 cell line. Thus, considering the importance that CTMs have over the hematopoietic system, we can conclude that, in aging, CTMs create a special environment which favors cell proliferation and maintenance of pluripotency, which can result in a dysregulation of the hematopoietic tissue when malignant cells are present

Influência da Delfinidina como potencial modulador da capacidade imunorregulatória das Células-Tronco Mesenquimais / Influence of Delphinidin as a potential modulator of the immunoregulatory capacity of Mesenchymal Stem Cells

As Células-Tronco Mesenquimais (CTMs), são células multipotentes, presentes em diversos tecidos, sendo bastante estudada devido sua capacidade imunorregulatória por meio da liberação de fatores solúveis. Fatores estes que atuam sobre as funções de células do sistema imunitário. Simultaneamente, estudos indicam que os compostos flavonoides, em destaque a Delfinidina, presente em alguns frutos e flores, possuem atuação anti-inflamatória e inibitória sobre células do sistema imunitário. Todavia, são escassos os estudos em relação entre a capacidade imunorregulatória da CTM e a influência da Delfinidina, sendo este o objetivo deste estudo. Inicialmente, a Delfinidina 3-O-ß-D-glicosídeo foi escolhido, devido a sua maior estabilidade e a dose de 50 µM foi selecionada após análise por citometria de fluxo que mostrou aumento da fase proliferativa do ciclo celular. Posteriormente ao realizar análise da produção de fatores solúveis pelas CTM, os resultados mostraram aumento da produção de IL-10, TGF-ß e Oxido nítrico pelas CTM tratadas com Delfinidina. Bem como, diminuição da expressão de p-NF-κB/NF-κB pelas CTMs tratadas com Delfinidina, quando avaliadas por Wersten Blot. Adicionalmente, para analisar a Delfinidina sobre os efeitos imunorregulatórios da CTM sob macrófagos (RAW 264.7), célula esta, importante no sistema imune inato. Foram realizadas culturas condicionadas, com posterior análise da produção de fatores solúveis, os resultados mostraram aumento da produção de IL-10, e diminuição da produção de TNF-α, IL-1α e IL-12 pelos macrófagos, nas culturas condicionadas. Assim como, diminuição da expressão do fator p-NF-κB/NF-κB pelos macrófagos nas culturas condicionadas, quando avaliadas por Wersten Blot. Ademais, ao analisar a atividade metabólica dos macrófagos por ensaio de MTT, os resultados mostraram que as culturas condicionadas e a Delfinidina per si foi capaz de diminuir a atividade metabólica, sem alterar os efeitos anti-inflamatórios sobre a célula. Em síntese, a Delfinidina mostrou acentuar a atuação imunorregulatória da CTM sobre a linhagem macrofágica, célula esta, de grande importância para o sistema imune inato

Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are multipotent cells present in various tissues, being widely studied due to their immunoregulatory capacity through the release of soluble factors. These factors act on the functions of cells of the immune system. Simultaneously, studies indicate that flavonoid compounds, especially Delphinidin, present in some fruits and flowers, have anti inflammatory and inhibitory effects on immune system cells. However, there are few studies on the relationship between the immunoregulatory capacity of MSC and the influence of Delphinidin, which is the objective of this study. Initially, Delphinidin 3-O-ß-D-glycoside was chosen due to its greater stability and the 50 µM dose was selected after analysis by flow cytometry which showed an increase in the proliferative phase of the cell cycle. Subsequently, when analyzing the production of soluble factors by MSCs, the results showed an increase in the production of IL-10, TGF-ß and nitric oxide by MSCs treated with Delphinidin. As well as decreased expression of p-NF-κB/NF-κB by MSCs treated with Delphinidin, when evaluated by Wersten Blot. Additionally, to analyze Delphinidin on the immunoregulatory effects of MSC on macrophages (RAW 264.7), this cell is important in the innate immune system. Conditioned cultures were performed, with subsequent analysis of the production of soluble factors, the results showed an increase in the production of IL-10, and a decrease in the production of TNF-α, IL-1α and IL-12 by macrophages, in the conditioned cultures. As well as decreased expression of p-NF-κB/NF-κB factor by macrophages in conditioned cultures, when evaluated by Wersten Blot. Furthermore, when analyzing the metabolic activity of macrophages by MTT assay, the results showed that conditioned cultures and Delphinidin itself was able to decrease the metabolic activity, without altering the anti-inflammatory effects on the cell. In summary, Delphinidin has shown to enhance the immunoregulatory action of MSC on the macrophage lineage, a cell that is of great importance for the innate immune system

Transformação leucêmica do microambiente das células-tronco hematopoiéticas

O microambiente das células-tronco hematopoiéticas é responsável por coordenar diversos eventos envolvidos na produção de células sanguíneas. Essa renovação hematopoiética só é possível graças às interações e sinalizações bem ordenadas que mantém a harmonia do tecido. Nas leucemias ocorre ruptura nesses mecanismos de controle e ocorre processo de transformação leucêmica do microambiente, de forma a favorecer a manutenção neoplásica do tecido sanguíneo. O objetivo deste estudo foi expor o processo de transformação leucêmica do microambiente, no âmbito das modificações celulares e moleculares sofridas para sustentar o tumor. Trata-se de um artigo de revisão narrativa e as bases de dados Pubmed, SciELO, Cocrahne Library e MedLine foram consultadas em busca de publicações dos últimos anos sobre o tema. Os dados apresentados contribuem para o entendimento holístico acerca das leucemias. A transformação leucêmica, seja por mutações primárias nos componentes do microambiente ou pelo sequestro de suas funções normais pelas células iniciadoras de leucemia, é relevante para que ocorra a instalação, a progressão, a disseminação e a quimiorresistência tumoral. Por meio da atuação de vários componentes este microambiente sustenta as células-tronco leucêmicas e representa caminho promissor para o desenvolvimento de novas terapias antileucêmicas

The microenvironment of hematopoietic stem cells is responsible for coordinating several events involved with the production of blood cells. This hematopoietic renewal is only possible thanks to the well-ordered interactions and signals that maintain tissue harmony. In leukemias, the control mechanisms break down and the leukemic transformation of the microenvironment occurs, thus favoring the neoplastic maintenance of blood tissue. From this perspective, this study aimed to investigate the microenvironment transformation process within the scope of cellular and molecular changes that support tumor progression. It is a narrative review article in which the Pubmed, SciELO, Cochrane Library, and MedLine databases were consulted in search of recent publications that addressed the proposed subject. The data obtained contribute to a more holistic understanding of leukemias. The leukemic transformation, either by primary mutations in the microenvironment components or through the sequestration of its normal functions by leukemia-initiating cells, is relevant for tumor establishment, progression, dissemination, and chemoresistance. Through the action of various components, this microenvironment supports leukemic stem cells and represents a promising path for developing new antileukemic therapies.

Potential effect of hyaluronic acid and triamcinolone acetate, alone or combined, on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells / Efecto potencial del ácido hialurónico y del acetato de triamcinolona solos o combinados sobre la diferenciación condrogénica de células-tronco mesenquimales / Efeito potencial do ácido hialurônico e triancinolona acetonida, isolados e combinados, na diferenciação condrogênica de células-tronco mensenquimais

Abstract Background: Osteoarthritis is a complex degenerative disease with several factors contributing to joint damage. Objective: To compare the potential effect of hyaluronic acid (HA) and triamcinolone acetonide (TA), alone or combined, on the in vitro chondrogenic differentiation process of mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were divided into four groups: Control, HA, TA, and HA/TA combined. Each treatment group was cultured for 14 days in chondrogenic differentiation medium. The chondrogenic differentiation potential was assessed by histology and immunohistochemistry. Results: The HA and HA/TA-treated MSCs presented histological characteristics similar to native chondrocytes. The extracellular matrix (ECM) of TA-treated MSCs was compact and organized. Glycosaminoglycan staining was intense in Control, moderate in TA, slight in HA/TA, and undetectable in HA. Type II collagen immunoreactivity was high in the TA-treated ECM and MSCs. Conclusions: Histological analysis shows that HA influences morphological development similar to chondrocytes of the MSCs, but with low expression of specific cartilage molecules. The TA promotes formation of a compact and organized ECM.

Resumen Antecedentes: La osteoartritis es una enfermedad degenerativa compleja en la cual varios factores contribuyen al daño articular. Objetivo: Comparar el efecto del ácido hialurónico (HA) y acetónido de triamcinolona (TA), solos o en combinación, en el proceso de diferenciación condrogénica in vitro de células madre mesenquimales (MSCs). Métodos: Las MSCs fueron divididas en cuatro grupos: Control, HA, TA y HA/TA, y cultivadas por 14 días en medio de diferenciación condrogénica para cada tratamiento. El potencial de diferenciación condrogénica fue analizado por medio de histología e inmunohistoquímica. Resultados: Las MSCs tratadas con HA y HA/TA, presentaron características histológicas similares a los condrocitos nativos, y la matriz extracelular (ECM) de MSCs tratadas con TA fue más compacta y organizada. La tinción de glicosaminoglicanos fue intensa en el Control, moderada en TA, ligera en HA/TA, y sin tinción en HA. La inmunoreactividad para colágeno tipo II fue más alta en las MSCs y ECM tratadas con TA. Conclusión: El análisis histológico muestra que el HA influencia un desarrollo morfológico similar a los condrocitos de las MSCs, pero con baja expresión de moléculas específicas de cartílago. La TA promueve la formación de una ECM compacta y organizada.

Resumo Antecedentes: A osteoartrite é uma doença degenerativa complexa, na qual vários fatores contribuem ao dano articular. Objetivo: Comparar o efeito do ácido hialurônico (HA) e Triancinolona acetonida (TA), só ou combinado no processo de diferenciação condrogênica in vitro de células tronco mesenquimais (MSCs). Métodos: MSCs foram divididas em 4 grupos: Controle, HA, TA y HA/TA e cultivadas por 14 dias com meio de diferenciação condrogênica e seus respectivos tratamentos. O potencial de diferenciação condrogênica foi acessado por meio de histologia e imunohistoquímica. Resultados: Histologicamente, MSCs tratadas com HA e HA/TA apresentaram características semelhantes de condrócitos nativos, e a matriz extracelular de MSCs tratadas com TA foi mais compacta e organizada. A coloração para glicosaminoglicanos foi intensa no Controle, moderada no TA, leve no HA/TA e sem coloração com HA. Para os grupos tratamento, a imunoreatividade para colágeno tipo II foi maior nas células e matriz extracelular tratadas com TA. Conclusão: Mediante análise histológica, o HA influenciou o desenvolvimento morfológico semelhante a condrócitos das MSCs, mas com baixa expressão de moléculas específicas de cartilagem. A TA promoveu a formação de uma matriz extracelular compacta e organizada.

In vitro evaluation of hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial to support bone healing / Avaliação in vitro do biomaterial compósito à base de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de carbono como adjuvante no reparo ósseo

Hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial were developed to improve bone healing. Previous studies suggested that a combination of biomaterials and mesenchymal stem cells (MSCs) can potentially help promote bone regeneration. In the present study, we first developed hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial. Then, the effect of different concentrations of the extract on the viability of Vero cells (ATCC CCL-81) and MSCs obtained from sheep bone marrow using methylthiazol tetrazolium (MTT) and propidium iodide (PI) assays were evaluated. The biomaterial group demonstrated an absence of cytotoxicity, similar to the control group. Samples with 50% and 10% biomaterial extract concentrations showed higher cell viability compared to samples from the control group (MTT assay). These results suggest that the presence of this composite biomaterial can be used with MSCs. This study also concluded that hydroxyapatite, chitosan, and carbon nanotube composite biomaterial were not cytotoxic. Therefore, these could be used for performing in vivo tests.(AU)

O compósito à base de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de carbono foi desenvolvido com o intuito de auxiliar na consolidação óssea. Estudos anteriores sugerem que a combinação de substitutos ósseos e células-tronco mesenquimais (CTM) podem auxiliar a potencializar e promover a regeneração óssea. No presente estudo, o biomaterial foi desenvolvido e a viabilidade e a citotoxicidade de células Vero (ATCC CCL-81) e CTM obtidas de medula óssea provenientes de ovinos utilizando ensaios metil-tiazol-tetrazólio, MTT e iodeto de propídeo (PI) foram avaliadas em diferentes concentrações de extrato desse compósito. O compósito demonstrou ausência de citotoxicidade com comportamento semelhante ao grupo controle. Amostras com 50% e 10% de concentração de extrato do compósito mostraram resultados maiores comparados ao grupo controle (ensaio MTT). Esses resultados também sugerem que a presença do biomaterial pode ser utilizada em associação a CTM. Assim, esse estudo conclui que o compósito apresentado de hidroxiapatita, quitosana e nanotubo de cabono não foi considerado citotóxico e pode ser utilizado em teste in vivo.(AU)

Awareness, attitude and ethical concern of dental practitioners about stem cells: a cross-sectional study / Consciência, atitude e preocupação ética dos dentistas sobre as células-tronco: um estudo transversal

Objective: To evaluate the level of awareness and attitude among dental practitioners regarding the use of stem cells in dentistry and to determine their knowledge of ethical concerns related to the recent therapy. Material and Methods: A cross-sectional survey-based study was conducted at Taibah University Dental College and Hospital. Medina and at governmental and private dental clinics at the western region of Saudi Arabia. Responses of dental practitioners who completed the survey were recorded between March 2019 and July 2019 without containing any personal identifiers. Level of awareness and attitude and knowledge about ethical issues in relation to stem cell therapy was established. Results: A total of 214 male and female dental practitioners participated in this study and the majority were registered at the Saudi Commission for Health Specialists 128 (59.8%). Dental consultants reported the highest percentage of awareness about dental stem cells (96%, p= 0.005), whereas general dental practitioners (56.2%, p= 0.005) and specialists (52%, p= 0.005), respectively had a lower percentage. When ethical concerns were determined, dental consultants had the highest percentage of knowledge (56%, p= 0.005), whereas dental practitioners (71.2%, p= 0.005) with < 5 years of experience (69.1, p= 0.002) lacked information about related ethical issues. Conclusion: Ways to increase stem cell awareness among dental practitioners in this study recommended including stem cell topics in the dental curriculum and organizing frequent seminars and conferences on this subject. (AU)

Objetivo: Avaliar o nível de consciência e a atitude dos dentistas em relação ao uso de células-tronco na odontologia, e determinar o conhecimento desses profissionais sobre as questões éticas relacionadas à terapia recente. Material e Métodos: Um estudo transversal baseado em pesquisa foi conduzido na Faculdade e Hospital de Odontologia da Universidade Taibah de Medina e em clínicas odontológicas governamentais e privadas na região oeste da Arábia Saudita. As respostas dos dentistas que responderam à pesquisa foram registradas entre março de 2019 e julho de 2019, sem conter nenhum identificador pessoal. Foi estabelecido o nível de consciência, atitude e conhecimento sobre questões éticas em relação à terapia com células-tronco. Resultados: Um total de 214 dentistas do sexo masculino e feminino participaram deste estudo, sendo 128 (59,8%) desses cadastrada na Comissão Saudita de Especialistas em Saúde. Os consultores em odontologia relataram o maior percentual de conhecimento sobre as células-tronco dentárias (96%, p = 0,005), enquanto os dentistas gerais (56,2%, p = 0,005) e especialistas (52%, p = 0,005) tiveram um percentual menor. Quando as questões éticas foram determinadas, os consultores em odontologia tiveram o maior percentual de conhecimento (56%, p = 0,005), enquanto os dentistas (71,2%, p = 0,005) com menos de 5 anos de experiência (69,1%, p = 0,002) tinham menos informações sobre questões éticas relacionadas. Conclusão: Formas de aumentar a conscientização sobre as células-tronco entre os dentistas deste estudo incluem tópicos sobre células-tronco no currículo de odontologia, além de frequentemente organizar seminários e conferências sobre o assunto. (AU)

Células-tronco mesenquimais de origem adiposa na fase de proliferação do processo de cicatrização de queimaduras frias / Adipose-derived stem cells in the proliferation phase of the healing process in cold burns

A criocirurgia tem sido utilizada no tratamento de diferentes enfermidades de sistemas e órgãos. Contudo, são relatados efeitos adversos, como cicatrização lenta, cicatrizes extensas, disfunção estética e funcional. As lesões que ocorrem naturalmente pela exposição ao frio extremo, comumente, resultam em gangrena. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência das células-tronco mesenquimais de origem adiposa (ADSCs) na fase de proliferação da cicatrização de feridas cutâneas. Por meio da aplicação do nitrogênio líquido pela técnica do spray aberto, realizou-se a indução de uma ferida, de aproximadamente 15mm de diâmetro, na região dorsal de cada rato. A ferida recebeu o tratamento de acordo com o grupo ao qual pertencia: 1) aplicação das ADSCs no 15º dia (grupo tratado); 2) aplicação da solução cloreto de sódio 0,9% no 15º dia (grupo sham); 3) nenhuma intervenção até o momento da eutanásia (grupo controle). O grupo tratado com as ADSCs apresentou as maiores taxas de contração média das feridas e obteve diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo sham quanto à neovascularização. A terapia com as ADSCs proporcionou uma relevante evolução clínica das feridas, podendo ser constatada ao final do período de avaliação por cicatrizes mais estreitas e compridas.(AU)

Cryosurgery has been used to treat different diseases of systems and organs, although adverse effects have been reported such as delayed wound healing, large scars, esthetical deformation and functional impairment. Injuries caused naturally by the exposure to extreme cold weather conditions mostly result in gangrene. This study aims to evaluate the influence of adipose-derived stem cells (ADSCs) in the proliferation phase on cutaneous wound healing. Through the application of liquid nitrogen by the spraying technique, a 15 millimeter diameter lesion was produced in the dorsal region of each rat. The wound received treatment according to the group it belonged: 1) ADSCs application on the 15th day (treated group); 2) application of 0.9% sodium chloride solution on the 15th day (sham group); 3) no intervention until euthanasia (control group). The group treated with ADSCs showed the highest wound average contraction rate; this group got a significant statistical difference in relation to the sham group when it refers to neovascularization. The ADSCs therapy provides an important clinical evolution of wounds. This was verified at the end of the evaluation period through narrower and longer scars.(AU)

Isolation and characterization of stem cells derived by human dental pulp from harvest based in rotary and manual techniques used in endodontic therapy / Isolamento e caracterização de células tronco da polpa dentária humana obtidas em instrumentação mecanizada e manual durante tratamento endodôntico

Objective: The aim of this study was to evaluate the impact on the isolation and characterization of stem cells from pulp tissues obtained through rotary instrumentation techniques compared to the manual technique. Material and Methods: Thirty permanent teeth were included, 15 of which were instrumented with rotational technique (Protaper SX) and other 15 with manual technique. Cells obtained were characterized by flow cytometry and proliferation was evaluated by the MTT assay. The plasticity was evaluated for adipogenic, osteogenic and odontogenic differentiations. Results: Cells isolated from the pulp of permanent teeth, by manual techniques, presented fibroblast morphology and were able to differentiate successfully. All lineages expressed CD29, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166 and were negative for CD31, CD34 and CD45. MTT assay showing significantly increased proliferation of hDPSCs in 5 and 7 days of the culture. Conclusions: The present study demonstrated that manual instrumentation technique is one of the best candidates to harvest dental pulp tissue as the dental stem cell source due to ability effective expanded with less tissue invasion. The technique of rotational instrumentation proved to be very harmful to the tissues of the dental pulp, and we can't obtain cells using this technique. (AU)

Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto no isolamento e caracterização de células-tronco de tecidos pulpares obtidos por meio de técnicas de instrumentação rotatória em comparação à técnica manual. Material e Métodos: Trinta dentes permanentes foram incluídos, 15 dos quais foram instrumentados com técnica mecanizada (Protaper SX) e outros 15 com técnica manual. As células obtidas foram caracterizadas por citometria de fluxo e a proliferação foi avaliada pelo ensaio MTT. A plasticidade foi avaliada quanto às diferenciações adipogênica, osteogênica e odontogênica. Resultados: células isoladas da polpa de dentes permanentes, por técnicas manuais, apresentaram morfologia de fibroblastos e foram capazes de se diferenciar com sucesso. Todas as linhagens expressaram CD29, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166 e foram negativas para CD31, CD34 e CD45. O teste de MTT mostrou proliferação significativamente aumentada de hDPSCs em 5 e 7 dias da cultura. Conclusões: O presente estudo demonstrou que a técnica de instrumentação manual é um dos melhores candidatos para a colheita de tecido pulpar como fonte de células tronco dentárias devido à boa capacidade de proliferação celular com menor invasão tecidual. A técnica de instrumentação rotatória provou ser muito prejudicial para os tecidos da polpa dentária, e não possibilitou obter células. (AU)

Protein malnutrition effects of perivascular bone marrow microenvironment on the regulation of hematopoiesis / Efeitos da desnutrição proteica sobre o microambiente perivascular medular na regulação da hematopoese

Protein malnutrition (PM) causes anemia and leukopenia by reduction of hematopoietic precursors and impaired production of mediators that induce hematopoiesis, as well as structural and ultrastructural changes in the bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in the bone marrow (BM) in distinct regions called niches, which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of the hematopoietic stem cell (HSC). The perivascular niche, composed mainly by mesenchymal stem cells (MSC) and endothelial cells (EC), is the major modulator of HSC and its function extends to the migration of mature hematopoietic cells into the peripheral blood through the production of cytokines and growth factors. Thus, our hypothesis is that PM changes the perivascular niche and our objective is to evaluate whether PM affects the modulatory capacity of MSC and EC on hematopoiesis. C57BL/6 male mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PM. We performed leukemic myelo-monoblasts cells transplantation and observed that these cells have a lower proliferation rate and are rather in the cell cycle G0/G1 phases in malnourished mice, indicating that the BM microenvironment is compromised in PM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC cells, which were evidenced by CD31 and CD144 markers. We performed the quantification of HSC and hematopoietic progenitors, as well as some regulators of proliferation and differentiation, ex vivo and after cultures with MSC or EC. We observed that PM reduces HSC and hematopoietic progenitors ex vivo. In PM, MSC promote increase in HSC and suppress hematopoietic differentiation, whereas ECs induce cell cycle arrest. Additionally, we verified that PM affects granulopoesis by decreasing the expression of G-CSFr in granule-monocytic progenitors. Thus, we conclude that PD compromises hematopoiesis due to intrinsic alterations in HSC, as well as alterations in the medullary perivascular niche

A desnutrição proteica (DP) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese. A hematopoese ocorre na medula óssea (MO) em regiões distintas chamadas de nichos, que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto renovação da célula tronco hematopoiética (CTH). O microambiente perivascular, composto principalmente por células tronco mesenquimais (CTM) e células endoteliais (CE), é o principal modulador das CTH e sua função se estende até a migração das células hematopoiéticas maduras para o sangue periférico, através da produção de citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, nossa hipótese é que a DP altera o microambiente perivascular e objetivamos avaliar se a DP afeta a capacidade modulatória das CTM e CE sobre a hematopoese. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoproteica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoproteica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DP. Realizamos transplantes de mielomonoblastos leucêmicos e observamos que estas células apresentam menor taxa de proliferação e se encontram em maior quantidade nas fases G0/G1 do ciclo celular em camundongos desnutridos, indicando que o microambiente medular está comprometido. Isolamos CTM, que foram caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE, o que foi evidenciado pelos marcadores CD31 e CD144. Quantificamos CTH e progenitores hematopoéticos, bem como reguladores de proliferação e diferenciação, ex vivo e após culturas com CTM ou CE. Observamos que a DP reduz CTH e progenitores hematopoéticos ex vivo. Na DP, as CTM promovem incremento de CTH e suprimem a diferenciação hematopoética, enquanto que as CE induzem parada no ciclo celular. Adicionalmente, observamos que a DP afeta a granulopoese por diminuição da expressão de G-CSFr nos progenitores grânulo-monocíticos. Dessa forma, concluímos que a DP compromete a hematopoese por alterações intrínsecas na CTH, como também por alterações ocasionadas no microambiente perivascular medular

Hemopoese em desnutrição proteica: caracterização do estroma medular e avaliação da participação do cálcio / Hematopoiesis in protein malnutrition: characterization of bone marrow stroma and evaluation of calcium participation

A desnutrição proteica continua sendo um dos principais problemas nutricionais do mundo. Trabalhos de nosso laboratório e de outros autores evidenciam que entre as alterações presentes na desnutrição proteica, está a alteração do tecido hemopoético, com modificações em componentes da matriz extracelular, alterações no ciclo celular da célula tronco/progenitora hemopoética, redução da produção de precursores hemopoéticos, tanto na série eritrocitária como na série leucocitária, levando a anemia e leucopenia. Os mecanismos de participação do Ca2+ nas células da medula óssea são pouco conhecidos, porém, sabe-se que ele atua no processo de hemopoese. Têm sido descrito que elevações da concentração de Ca2+ citoplasmático induzem a proliferação e diferenciação de células mielóides. A ação dessa via em indivíduos desnutridos também é pouco conhecida. Este estudo tem como objetivo avaliar o estabelecimento da celularidade medular in vitro, bem como investigar mecanismos moleculares envolvidos na proliferação e diferenciação dessa celularidade, além de avaliar a ação do cálcio na presença da interleucina-3 em células-tronco hemopoéticas murinas e sua modulação para avaliar alterações na via das MAPKs. Camundongos C57BL/6, machos e adultos foram submetidos à desnutrição proteica e, após a perda de aproximadamente 20% de seu peso corporal, as células da medula óssea foram colhidas. Essas células foram imunofenotipadas, além de reagirem com anticorpos específicos para caracterização da célula-tronco hemopoética e proteínas da via de sinalização de cálcio intracelular. Observamos que a celularidade do estroma medular em cultura de longa duração de animais desnutridos é alterada, principalmente em células de origem mesenquimal, que aparecem em maior número em desnutridos ao longo dos dias de cultura. Além disso, as ondas de cálcio intracelular estavam diminuídas em animais desnutridos, bem como as proteínas p-PKC, p-PLCy, CAMKII, p-AKT e p-STAT5 não respondem ao estímulo de IL-3, levando a uma deficiência da expressão das MAPK: ERK 1/2, JNK e p38. A desnutrição proteica pode causar alterações na celularidade estromal da medula óssea e na diferenciação das células tronco hemopoéticas pela via das MAPKs estimulada por IL-3

Protein malnutrition remains one of the world's major nutritional problems. Studies from our laboratory and others shown that alterations in protein malnutrition include hemopoietic tissue alterations, changes in extracellular matrix components, changes in the hemopoietic stem/progenitor cell tissue, reduction in the production of hemopoietic precursors, in the erythroid series as in the mieloyd series, leading to anemia and leukopenia. Mechanisms of Ca2+ participation in bone marrow cells are poorly understood, but no hemopoiesis has been developed. Elevations of cytoplasmic Ca2+ concentration in proliferation and differentiation of myeloid cells were included. Such an action through malnourished animals is also a little known. This study aims to evaluate the establishment of cellularity in vitro as well as investigate the molecular involvement in cell proliferation and differentiation, as well as to evaluate the action of calcium in the presence of IL-3 in hemopoietic stem cells and its modulation by analytical evaluations in the MAPKs pathway. C57BL/6, male adult mices were subjected to protein restriction and, after loss of approximately 20% of their body weight, bone marrow cells were harvested. These were immunophenotyped in addition to specific activation terms for the hemopoietic stem cell and intracellular signaling pathway proteins. We observed that the bone marrow cells in long-term culture of malnourished animals is altered, mainly in cells of mesenchymal origin, which appears in greater numbers in undernourished throughout the days of culture. In addition, as intracellular calcium waves decreased in malnourished animals, as well as the p-PKC, p-PLC, CAMKII, p-AKT and p-STAT5 proteins did not respond to IL-3, sugesting expression of the expression of MAPK: ERK 1/2, JNK and p38. Protein malnutrition may have changes in bone marrow capacity and differentiation of hemopoietic stem cells through IL-3-stimulated MAPKs

The Effect of Mesenchymal Stem Cells on Fertility in Experimental Retrocervical Endometriosis / O efeito das células-tronco mesenquimais na fertilidade em endometriose retrocervical experimental

Abstract Purpose To evaluate the effect of mesenchymal stem cells (MSCs) on fertility in experimental retrocervical endometriosis. Methods A total of 27 New Zealand rabbits were divided into three groups: endometriosis, in which endometrial implants were created; mesenchymal, in which MSCs were applied in addition to the creation of endometrial implants; and control, the group without endometriosis. Fisher's exact test was performed to compare the dichotomous qualitative variables among the groups. The quantitative variables were compared by the nonparametric Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests. The MannWhitney test was used for post-hoc multiple comparison with Boniferroni correction. Results Regarding the beginning of the fertile period, the three groups had medians of 14±12.7, 40±5, and 33±8.9 days respectively (p = 0.005). With regard to fertility (number of pregnancies), the endometriosis and control groups showed a rate of 77.78%, whereas the mesenchymal group showed a rate of 11.20% (p = 0.015). No differences in Keenan's histological classification were observed among the groups (p = 0.730). With regard to the macroscopic appearance of the lesions, the mesenchymal group showed the most pelvic adhesions. Conclusion The use of MSCs in endometriosis negatively contributed to fertility, suggesting the role of these cells in the development of this disease.

Resumo Objetivo Avaliar o efeito das células-tronco mesenquimais sobre a fertilidade na endometriose retrocervical experimental. Métodos Um total de 27 coelhas da raça Nova Zelândia foram divididas em três grupos: endometriose, em que os implantes endometriais foram criados; mesenquimal, em que as células-tronco mesenquimais foram aplicadas complementarmente à criação implantes endometriais; e controle, sem endometriose. O teste exato de Fisher foi realizado para comparar variáveis dicotômicas qualitativas entre os grupos. As variáveis quantitativas foram comparadas pelos testes não paramétricos de MannWhitney e Kruskal-Wallis. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para a comparação múltipla pós-hoc com correção de Boniferroni. Resultados em relação ao início do período fértil, os grupos endometriose, mesenquimal e controle tiveram medianas de 14±12,7; 40±5; e 33±8,9 dias, respectivamente (p = 0,005). Sobre a taxa de fertilidade (número de gravidezes), os grupos endometriose e controle mostraram uma taxa de 77,78%, enquanto o grupo mesenquimal mostrou uma taxa de 11,20% (p = 0,015). Não foram observadas diferenças na classificação histológica de Keenan entre os grupos (p = 0,730). No que diz respeito à aparência macroscópica das lesões, o grupo mesenquimal mostrou maiores adesões pélvicas. Conclusão O uso de células-tronco mesenquimais na endometriose contribuiu negativamente para a fertilidade, sugerindo o papel dessas células no desenvolvimento da doença.

Sinusitis in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation – a review / Sinusite em pacientes submetidos a transplante alogênico de medula óssea – uma revisão

Abstract Introduction Sinusitis is a common morbidity in general population, however little is known about its occurrence in severely immunocompromised patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Objective The aim of the study was to analyze the literature concerning sinusitis in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation. Methods An electronic database search was performed with the objective of identifying all original trials examining sinusitis in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients. The search was limited to English-language publications. Results Twenty five studies, published between 1985 and 2015 were identified, none of them being a randomized clinical trial. They reported on 31–955 patients, discussing different issues i.e. value of pretransplant sinonasal evaluation and its impact on post-transplant morbidity and mortality, treatment, risk factors analysis. Conclusion Results from analyzed studies yielded inconsistent results. Nevertheless, some recommendations for good practice could be made. First, it seems advisable to screen all patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with Computed Tomography (CT) prior to procedure. Second, patients with symptoms of sinusitis should be treated before hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), preferably with conservative medical approach. Third, patients who have undergone hematopoietic stem cell transplantation should be monitored closely for sinusitis, especially in the early period after transplantation.

Resumo Introdução A sinusite é uma doença comum na população em geral, porém pouco se sabe sobre a sua ocorrência em pacientes gravemente imunocomprometidos submetidos a transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas. Objetivo O objetivo do estudo foi analisar a literatura sobre sinusite em pacientes submetidos a transplante alogênico de medula óssea. Método Uma busca na base de dados eletrônica foi realizada com o objetivo de identificar todos os artigos originais que investigaram sinusite em receptores de transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas. A busca foi limitada a publicações em língua inglesa. Resultados Foram identificados 25 estudos, publicados entre 1985 e 2015, sendo que nenhum deles era um ensaio clínico randomizado. Eles incluíram 31-955 pacientes, discutindo diferentes questões, ou seja, valor da avaliação sinonasal pré-transplante e seu impacto na morbidade e mortalidade pós-transplante, tratamento, análise de fatores de risco. Conclusão Os resultados dos estudos analisados produziram resultados inconsistentes. No entanto, algumas recomendações para boas práticas poderiam ser feitas. Em primeiro lugar, parece aconselhável avaliar todos os pacientes submetidos a transplante alogênico de hematopoiéticas com tomografia computadorizada (TC) antes do procedimento. Em segundo lugar, os pacientes com sintomas de sinusite devem ser tratados antes de um Transplante de Células-Tronco Hematopoiéticas (TCTH), de preferência com abordagem clínica conservadora. Em terceiro lugar, os pacientes que se submeteram a TCTH devem ser cuidadosamente monitorizados para sinusite, especialmente no período inicial após o transplante.

Isolation and characterization of mesenchymal stem cells derived from bovine Wharton's jelly and their potential for use in cloning by nuclear transfer / Isolamento e caracterização de células tronco mesenquimais derivadas de geléia de Wharton bovina e seu potencial para uso na clonagem por transferência nuclear

ABSTRACT: Wharton's jelly is a source of mesenchymal stem cells (MSCs) that had not yet been tested for bovine embryo production by nuclear transfer (NT). Thus, the objective of this study was to isolate, characterize and test MSCs derived from Wharton's jelly for embryo and pregnancy production by NT in cattle. The umbilical cord was collected during calving and cells derived from Wharton's jelly (WJCs) were isolated by explant and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium. Skin Fibroblasts (FB) were isolated after 6 months of life. Morphological analysis was performed by bright field and scanning electron microscopy (SEM) during cell culture. Phenotypic and genotypic characterization by flow cytometry, immunocytochemistry, RT-PCR and differentiation induction in cell lineages were performed for WJC. In the NT procedure, oocytes at the arrested metaphase II stage were enucleated using micromanipulators, fused with WJCs or FB and later activated artificially. SEM micrographs revealed that WJCs have variable shape under culture. Mesenchymal markers of MSCs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) were expressed in bovine-derived WJC cultures, as evidenced by flow cytometry, immunocytochemistry and RT-PCR. When induced, these cells differentiated into osteocytes, chondrocytes and adipocytes. After classification, the WJCs were used in NT. Blastocyst formation rate by NT with WJCs at day 7 was 25.80±0.03%, similar to blatocyst rate with NT using skin fibroblasts (19.00±0.07%). Pregnancies were obtained and showed that WJCs constitute a new cell type for use in animal cloning.

RESUMO: A geleia de Wharton é uma fonte de células tronco mesenquimais (CTMs) que ainda não havia sido testada para a produção de embriões bovinos por transferência nuclear (TN). O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e testar as CTMs derivadas da geleia de Wharton para produção de embriões e gestações por transferência nuclear em bovinos. O cordão umbilical foi coletado durante o nascimento e as células derivadas da geleia de Wharton (CGWs) foram isoladas por explante e cultivadas em Dulbecco's Modified Eagle Medium. Fibroblastos (FB) da pele foram isolados após 6 meses de vida. As análises morfológicas foram realizadas pelas microscopias de campo claro e eletrônica de varredura durante o cultivo celular. Caracterização fenotípica e genotípica por citometria de fluxo, imunocitoquímica, RT-PCR e indução da diferenciação em linhagens celulares foi realizada com as CGWs. No procedimento de TN, ovócitos no estágio de metáfase II foram enucleados usando micromanipuladores, fusionados com CGWs ou FB e então ativados artificialmente. Micrografias de microscopia de varredura revelaram que CGWs tiveram forma variada sob cultivo. Os marcadores mesenquimais de CTMs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) foram expressos em cultura de CGWs bovina, como evidenciado por citometria de fluxo, imunocitoquímica e RT-PCR. Quando induzidas, estas células diferenciaram-se em osteócitos, condrócitos e adipócitos. Após classificação, as CGWs foram utilizadas na TN. A taxa de formação de blastocistos por TN com CGWs no sétimo dia de cultivo foi de 25,80±0,03%, similar a produção de blastócitos por TN com fibroblastos de pele (19,00±0,07). Gestações foram obtidas e mostraram que CGWs constituem um novo tipo celular para ser usado na clonagem animal.

Células-tronco derivadas do epitélio olfatório: perspectivas terapêuticas na medicina veterinária / Stem cells derived from olfactory epithelium: therapeutic perspectives in veterinary medicine

O epitélio olfatório (EO) é uma fonte promissora de células-tronco (CTEO) para o uso terapêutico na medicina veterinária e humana, especialmente em doenças correlacionadas com o sistema nervoso periférico (medula espinhal) e central (cérebro e tronco encefálico) , pois as CTEO possuem a capacidade de se diferenciar em células do sistema nervoso, tais como: neurônios, oligodendrócitos e astrócitos. Em humanos estas células são utilizadas em ensaios terapêuticos de doenças degenerativas como o Alzheimer e Parkinson. Em animais a casuística relativa das doenças neurodegenerativas crônicas ou agudas é baixa, devido à dificuldade de diagnóstico definitivo, desta forma o enfoque das pesquisas com terapia celular são em sua grande maioria em lesões mecânicas na medula espinhal. Devido à falta de padronização e seleção das melhores metodologias que permitam confrontação de estudos, esta revisão busca reunir as mais recentes publicações, descrevendo o potencial uso das células-tronco do epitélio olfatório em terapias celulares, discutindo os principais desafios e perspectivas futuras com enfoque na medicina veterinária.(AU)

The olfactory epithelium (OE) is a promising source of stem cells (OESC) for therapeutic use in veterinary and human medicine, especially in diseases correlated with the peripheral (spinal cord) and central (brain and brainstem) nervous system (CNS), because of its ability to differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes cells. In humans, OESC has been used primarily in therapeutic trials for degenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. In animals, the frequency of corresponding cases of chronic or acute neurodegenerative diseases is very low, because of the difficulty of a definitive diagnosis; thus, the focus of cell therapy research are mostly mechanical spinal cord injuries. Due to the lack of normalization and selection of the best methodologies for comparative studies, this review aims to analyze recent reports on the potential use of stem cells from the olfactory epithelium in cell therapies and to discuss the main challenges and future prospects in veterinary medicine.(AU)

Participação do nicho endosteal na regulação da hemopoese de camundongos submetidos à desnutrição proteica / Endosteal niche participation in the hematopoiesis of mice submitted to protein malnourishment

O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação. As CTH podem ser classificadas em dois grupos: células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal

The bone marrow endosteal niche hosts hematopoietic stem cells (HSC) in quiescence/self-renewal. HSC can be classified into two groups: cells capable of renewing indefinitely (LT-HSC) or repopulating in the short term (ST-HSC). In this work, we investigated the effects of protein malnutrition (PM) on bone tissue and the involvement of the endosteal niche in osteoblast-CTH signaling. Therefore, we used mice subjected to PM induced by the consumption of hypoproteic feed. Malnourished animals presented pancytopenia and decreased concentration of serum protein and albumin. We quantified the HSC by flow cytometry and found that the malnourished ones had lower percentage of LT-HSC, ST-HSC and multipotent progenitors (MPP). We assessed the expression of the CD44, CXCR4, Tie-2 and Notch-1 proteins in LT-HSC. We observed decreased expression of CD44 protein with the malnourished ones. We isolated the LT-HSC cells by means of cell sorting and assessed the gene expression of CD44, CXCR4 and NOTCH-1. We found that malnutrition had lower expression of CD44. Regarding the cell cycle, we see greater amount of LT-HSC in the G0 and G1 phases. We characterized the changes of the femoral bone tissue in vivo. We observed a decrease in the bone mineral density and medullar density in malnourished animals. As for malnourished animals, the femoral cortical region showed a significant decrease in tissue area, periosteal and endosteal perimeter. The femoral trabecular region of malnourished animals showed decreased bone volume/tissue volume ratio, decreased trabecular number, increased trabecular separation and prevalence of rod-like trabeculae. We investigated the expression of collagen, osteonectin (ON) and osteocalcin (OC) by means of immunohistochemistry and the expression of osteopontin (OPN) by immunofluorescence and we found that malnourished animals showed decreased labeling for OPN, type I collagen, OC and ON in the cortical region of the femur. Picrosirius staining was used to analyze disorganization of collagen fibers and presence of type III fibers in the femurs of the malnourished. Cortical and trabecular regions of malnourished animals presented a higher number of osteoclasts as shown by tartrate-resistant acid phosphatase reaction. Moreover, osteoblasts were isolated from the femoral region by immunomagnetic depletion and immunophenotyped by flow cytometry and cultured in osteogenic induction medium. Results proved less positive for alkaline phosphatase and alizarin red in the cultures of osteoblasts of malnourished animals. We assessed, by means of Western blotting, type I collagen expression, OPN, osterix, Runx2, RANKL and osteoprotegerin (OPG) and, by real time PCR, the expression of COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 and CDH2 with the isolated osteoblasts. We found that malnutrition led to osterix and OPG decreased protein expression and lower ANGPT1 gene expression. We evaluated LSK cell (Lin-Sca1+c-Kit+) proliferation by CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester). LSK cells and osteoblasts (MC3T3-E1) cocultures were performed in the presence and absence of anti-CD44. After a week, we found lower proliferation of LSK in the malnourished. The LSK CD44 blocking in the control group decreased the proliferation of these three generations. However, as for the malnourished, such blockage did not affect proliferation. We concluded that the PM has promoted changes in bone tissue and the CTH. However, we can't claim that the alterations observed in hematopoietic system were due to endosteal niche-only changes

Repercussões na saúde mental dos sobreviventes ao transplante de células tronco hematopoiéticas para tratamento do câncer hematológico na infância e na adolescência: revisão sistemática da literatura / Repercussions on the mental health of hematopoietic stem cell transplant survivors for the treatment of hematologic cancer in childhood and adolescence: a systematic review of the literature

O transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH) é uma modalidade de tratamento oncológico associada a consideráveis níveis de morbidade. Num cenário onde pacientes sobrevivem por períodos mais longos de tempo, tem sido dada atenção às sequelas tardias deste procedimento. A presente revisão sistemática pretende compilar as informações publicadas acerca da prevalência de transtornos mentais entre os sobreviventes ao TCTH para tratamento das neoplasias hematológicas e linfoides na infância e na adolescência, bem como os possíveis fatores associados à ocorrência desses transtornos. Foram utilizadas 13 bases de dados para pesquisar publicações desde 1990 até janeiro de 2016. Após aplicação de critérios de inclusão e exclusão, foram selecionados oito artigos para revisão. Foram estudados 8449 indivíduos, dentre os quais 1009 sobreviventes ao TCTH. A idade média ao diagnóstico variou de 5 a 9 anos e os indivíduos foram avaliados de 1 a 16 anos após o diagnóstico. Os desfechos em saúde mental estudados foram os domínios psicológicos e mentais das escalas de qualidade de vida (QV), depressão, distúrbios de conduta, auto estima, e transtornos hipercinéticos, do comportamento, do funcionamento social, da alimentação e do sono, sendo utilizados nove instrumentos diferentes para avaliação. Dentre os resultados encontrados, observa-se que os desfechos tendem a ser mais desfavoráveis quando os pais são os respondentes dos questionários em comparação com aqueles em que os próprios pacientes os respondem. Os resultados também tendem a ser piores quando os pacientes já são adultos, quando em comparação com a avaliação realizada ainda na infância ou adolescência, e menos favoráveis quando a população de transplantados é comparada com a população geral, com diferenças menos significativas quando esta comparação se faz com pacientes não transplantados. Os efeitos físicos tardios, a intensidade do tratamento sobre o Sistema Nervoso Central (SCN) e a depressão materna foram reconhecidos como possíveis variáveis explicativas para alterações na saúde mental dos sobreviventes. Quanto à qualidade dos artigos, a maioria recebeu menos de dois terços da pontuação máxima da Newcastle - Ottawa Quality Assessment Scale. O presente estudo apresenta limitações impostas pelo número escasso de artigos e pelas diferenças metodológicas dos estudos sobre o tema. A heterogeneidade dos estudos não permitiu a realização de metanálise. Contudo, esta revisão apresenta-se como a primeira a agrupar o conhecimento até então publicado sobre a saúde mental dos sobreviventes ao TCTH na infância e adolescência como parte do tratamento para as neoplasias hematológicas e linfoides. Seus resultados levam ao reconhecimento da importância deste tema, bem como às lacunas que ainda se apresentam. Sendo tais neoplasias as mais frequentes entre crianças e adolescentes, com taxas cada vez mais altas de sobrevivência, há que se pensar sobre a possível subnotificação destas consequências. O rastreamento das sequelas mentais no seguimento a longo prazo dessa população poderia trazer à tona um retrato mais fidedigno das repercussões mentais, que tanto a doença quanto seu agressivo tratamento com TCTH podem gerar

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a modality of oncological treatment associated with considerable levels of morbidity. In a setting where patients survive for longer periods of time, attention has been paid to the late sequelae of this procedure. The present systematic review aims to compile the published information on the prevalence of mental disorders among survivors of HSCT for the treatment of hematological and lymphoid neoplasms in childhood and adolescence, as well as the possible factors associated with the occurrence of these disorders. We used 13 databases to search publications from 1990 to January 2016. After applying inclusion and exclusion criteria, eight articles were selected for review. A total of 8449 individuals were studied, including 1009 survivors of HSCT. The mean age at diagnosis ranged from 5 to 9 years and subjects were assessed from 1 to 16 years after diagnosis. The mental health outcomes studied were the psychological and mental domains of quality of life (QoL), depression, behavioral disorders, self-esteem, and hyperkinetic disorders, behavior, social functioning, eating and sleep, being used nine different instruments for evaluation. Among the results found, it is observed that the outcomes tend to be more unfavorable when the parents are the respondents of the questionnaires compared to those in which the patients themselves respond. The results also tend to be worse when patients are already adults, when compared to the evaluation performed in childhood or adolescence, and less favorable when the transplant population is compared to the general population, with less significant differences when this comparison with non-transplanted patients. Late physical effects, intensity of treatment on the Central Nervous System (CNS) and maternal depression were recognized as possible explanatory variables for changes in the mental health of survivors. As for the quality of the articles, the majority received less than two thirds of the Newcastle - Ottawa Quality Assessment Scale. The present study presents limitations imposed by the scarce number of articles and the methodological differences of the studies on the subject. The heterogeneity of the studies did not allow meta-analysis. However, this review is the first to group previously published knowledge on the mental health of survivors of HSCT in childhood and adolescence as part of the treatment for hematological and lymphoid neoplasms. Its results lead to the recognition of the importance of this theme, as well as to the gaps that still exist. As these neoplasms are the most frequent among children and adolescents, with increasing rates of survival, it is necessary to think about the possible underreporting of these consequences. The tracking of mental sequelae in the long-term follow-up of this population could bring to the surface a more reliable picture of the mental repercussions that both the disease and its aggressive treatment with HSCT can generate

Mieloma múltiplo aos 30 anos: o avesso da epidemio / Multiple myeloma at 30: the reverse of the epidemiology

Mieloma múltiplo é uma neoplasia maligna resultante da proliferaçãoclonal de plasmócitos no microambiente da medula óssea.É doença relacionada à senilidade, com pico de incidência entre60 e 70 anos, sendo incomum em pessoas jovens. Caracteriza-sepela produção de imunoglobulinas monoclonais e disfunçãoorgânica, incluindo doença óssea, anemia, insuficiência renal ehipercalcemia. O tratamento depende da idade principalmentebiológica do paciente, sendo indicada para os pacientes comidade inferior a 65 anos e sem comorbidades importantes terapiade indução com múltiplas drogas (por exemplo: talidomida,lenalidomida e bortezomibe), transplante de células-troncohematopoéticas e manutenção pós-transplante com talidomidaou lenalidomida. Descrevemos o caso de um paciente com mielomamúltiplo diagnosticado aos 30 anos de idade, submetidoa transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas comterapia de manutenção com talidomida, que mantém remissãocompleta da doença até então.(AU)

Multiple myeloma is a neoplastic disorder that is originatedfrom clonal proliferation of malignant plasma cells in thebone marrow microenvironment. It is a disease of the elderly,with a peak incidence between 60 and 70 years of age and itis uncommon in young people. The disease is characterizedby monoclonal protein production and associated organdysfunction, including bone disease, anemia, renal insufficiencyand hypercalcemia. The treatment is mainly related to biologic age and it is usually recommended for patients under the ageof 65 years who do not have substantial comorbidities theinduction therapy with multiple drugs (such as thalidomide,lenalidomide, or bortezomib), plus hematopoietic stem-celltransplantation and maintenance therapy with thalidomide orlenalidomide after transplantation. This case report is about a30-year-old man diagnosed with multiple myeloma treated withautologous stem-cell transplantation and maintenance therapywith thalidomide, who has been remaining in remission.(AU)

Anticoagulants on yield of bone marrow-derived mononuclear cells harvested from dogs / Anticoagulantes no rendimento de células mononucleares da medula óssea de cães

Cell therapy with bone marrow-derived mononuclear cells is an alternative to therapy with mesenchymal stem cell cultures. The aim of the present research was the comparison of the yield of bone marrow-derived mononuclear cells harvested from dogs with two different anticoagulants. Bone marrow was harvested from the iliac crest of five healthy dogs aged between 15 and 30 months, and the effect of two anticoagulant solutions, CPDA-1 (citrate phosphate dextrose adenine-1) and heparin, on the isolation of mononuclear cells was compared. Mononuclear cells were isolated in a density gradient and stained for CD9 and CD44 for characterization by flow cytometry. Means were compared using Student's paired t-test. Samples harvested with CPDA-1 yielded an average of 5.16x106 (±1.76x106) to 20.20x106 (±1.55x106) mononuclear cells/mL, whereas the yield of samples harvested with heparin varied between 4.56x106(±0.69x106) and 24.30x106 (±2.12x106) mononuclear cells mL-1. By flow cytometry, mean percentage of double-stained cells varied from 1.96% (±0.64%) to 5.01% (±0.73%) for CPDA-1 and from 2.23% (±0.70%) to 7.27% (±0.97%) for heparin. No significant statistical differences were observed on yield or CD9 and CD44 expression. Further studies are recommended to assess efficacy of CPDA on mononuclear cell isolation.

A terapia com células mononucleares de medula óssea é uma alternativa ao cultivo de células-tronco mesenquimais. O objetivo deste trabalho foi comparar o rendimento de células mononucleares derivadas da medula óssea de cães, colhidas com dois anticoagulantes diferentes. Foram coletadas medulas ósseas de cinco cães hígidos, com idades variando entre 15 e 30 meses, por punção na crista ilíaca. Foi comparado o efeito da solução anticoagulante no isolamento das células mononucleares, utilizando-se CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrose, adenina) ou heparina como soluções anticoagulantes. As células mononucleares foram isoladas em gradiente de densidade e caracterizadas fenotipicamente em citometria de fluxo. Os resultados foram submetidos ao Teste t pareado para comparação de médias. Nas amostras coletadas com CPDA-1, o rendimento médio variou entre 5,16 x 106 (±1,76x106) a 20,20x106 (±1,55x106) células mononucleares mL-1, enquanto que, nas amostras coletadas com heparina, o rendimento variou entre 4,56x106 (±0,69x106) a 24,30x106(±2,12x106) células mononucleares/mL. Na citometria de fluxo, a média de células duplo-marcadas variou de 1,96% (±0,64%) a 5,01% (±0,73%) para CPDA-1 e de 2,23% (±0,70%) a 7,27% (±0,97%) para heparina. Não foram observadas diferenças estatísticas no rendimento ou na expressão de CD9 e CD44. Recomendam-se estudos adicionais para avaliar melhor a eficácia do CPDA no isolamento de células mononucleares.

Influência da L-glutamina sobre aspectos imunomodulatórios de células tronco mesenquimais medulares em situação de desnutrição proteico-energética / The influence of L-glutamine on imunumodulatory aspects of bone marrow mesenchymal stem cells under protein-energy malnutrition

A desnutrição proteico-energética (DPE) altera a hemopoese e, portanto, a geração de células imunológicas, bem como compromete o sistema imune. Desta forma, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. As células tronco mesenquimais (CTMs) possuem propriedades imunomodulatórias e são importantes na formação do estroma medular que sustenta a hemopoese. Visto que a L-glutamina (GLUT) é o aminoácido condicionalmente essencial mais consumido por CTMs, e que também apresenta capacidade imunomoduladora, investigou-se, neste trabalho, se a GLUT exerceria efeito sobre aspectos imunomodulatórios das CTMs em um modelo experimental de DPE. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c, os quais receberam rações normoproteica ou hipoproteica isocalóricas contendo, respectivamente, 12% e 2% de proteína por um período de 5 semanas. Após o isolamento e a caracterização de CTMs provenientes dos grupos controle (CTMct) e desnutrido (CTMdesn), cultivou-se essas células em 0, 0,6, 2 e 10mM GLUT, a fim de determinar a influência deste aminoácido sobre a expressão de fatores de transcrição e produção de citocinas por CTMct e CTMdesn. Adicionalmente, avaliou-se o efeito dos sobrenadantes das culturas de CTMct e CTMdesn sobre a proliferação e produção de citocinas por macrófagos e linfócitos esplênicos. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração de proteínas séricas, albumina e préa-lbumina. A DPE não modificou a morfologia e o fenótipo das CTMs, bem como não alterou a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular. Por outro lado, a expressão de NFkB e STAT-3 e a produção de IL-1ß, IL-6, IL-10 e TGF-ß por CTMs foram alteradas pela DPE e variaram de acordo com as concentrações de GLUT testadas. O aumento na concentração de GLUT diminuiu a expressão de NFkB e induziu a expressão de STAT-3 por CTMs obtidas de ambos os grupos. Quanto a produção de citocinas por essas células, observou-se uma diminuição nos níveis de IL-ß e IL-6 e uma elevação nos níveis de IL-10 e TGF-ß com o aumento na concentração de GLUT. Variações na concentração desse aminoácido não alteraram a produção de IL-17 ou IFN-γ por CTMct e CTMdesn. Ademais, a concentração de GLUT alterou, de forma diretamente proporcional, a taxa de proliferação das CTMs. Os meios condicionados de CTMct e CTMdesn diminuíram a proliferação de macrófagos e linfócitos esplênicos estimulados com LPS, induziram aumento na produção da citocina antiinflamatória IL-10 por ambos os tipos celulares e diminuíram a produção das citocinas pró-inflamatórias IL-12 e TNF-α por macrófagos e IL-17 por linfócitos. Portanto, conclui-se que a GLUT possui efeito sobre a proliferação das CTMs, bem como a capacidade de imunomodular estas células

Protein-energy malnutrition (PEM) alters hemopoiesis and, therefore, the generation of immune cells, and compromises the immune system. In this way, malnourished individuals are more susceptible to infections. Mesenchymal stem cells (MSCs) have immunomodulatory properties and are important in the formation of bone marrow stroma that supports hemopoiesis. Since L-glutamine (GLUT) is a conditionally essential amino acid, which is most consumed by MSCs, and present immunomodulatory capacity, this work investigated whether GLUT would have an effect on immunomodulatory aspects of MSCs in a PEM experimental model. For this purpose, BALB/c mice were used, which received isocaloric normoproteic or hypoproteic diets, containing respectively, 12% and 2% of protein for a period of 5 weeks. After isolation and characterization of MSCs from control (MSCct) and malnourished (MSCmaln) groups, these cells were cultured with 0, 0.6, 2 and GLUT 10mM in order to determine the influence of this amino acid on the expression of transcription factors and cytokine production by MSCct and MSCmaln. Besides that, the effect of MSCct and MSCmaln culture supernatants on proliferation and cytokine production by macrophages and splenic lymphocytes was evaluated. Malnourished animals presented anemia, leucopenia, marrow hypoplasia and decreased concentration of serum proteins, albumin and prealbumin. PEM did not change morphology and phenotype of MSCs or altered the expression of cell cycle regulatory proteins. On the other hand, the expression of NFkB and STAT-3 and the production of IL-1ß, IL-6, IL-10 and TGF-ß by MSCs were modified by PEM and varied according to the tested GLUT concentrations. An increase in GLUT concentration decreased NFkB expression and induced STAT-3 expression by MSCs obtained from both groups. Regarding the production of cytokines by these cells, an increase in GLUT concentration resulted in decreased IL-1ß and IL-6 levels and increased IL- 10 and TGF-ß levels. Changes in the concentration of this aminoacid did not alter IL- 17 or IFN-γ production by MSCct and MSCmaln. Furthermore, the concentration of GLUT changed, in direct proportion, the proliferation of MSCs. The conditioned media MSCct and MSCmaln decreased the proliferation of macrophages and splenic lymphocytes stimulated with LPS, induced an increase in the production of the antiinflammatory cytokine IL-10 by both cell types, and decreased the production of proinflammatory cytokines IL-12 and TNF-α by macrophages and IL-17 by lymphocytes. Therefore, it can be concluded that GLUT has an effect on the proliferation of MSCs and it has the capacity to immunomodulate these cells

Efeitos do LRP6 e Frizzled6 na diferenciação endotelial de DPSC / LRP6 and Frizzled6 effects in the endothelial differentiation of DPSC

O objetivo deste estudo foi avaliar a função da via de sinalização Wnt/β-catenina através dos receptores LRP6 e Frizzled6 na diferenciação de células-tronco de polpa dental de dentes permanentes (DPSC) em células endoteliais. DPSC foram transduzidas com marcadores eGFP e vetores lentivirais shRNA (LRP6, Frizzled6 ou vetor vazio - controle) para os experimentos. Os testes in vitro avaliaram a expressão de GSK3-β e β-catenina por western blot na presença de rhWnt1 e rhVEGF165 e de VEGFe CXCL-8 (IL-8) por ELISA. A expressão de marcadores endoteliais (western blot e PCR) e formação de túbulos capilares foram analisados após a diferenciação endotelial das DPSCs. In vivo, fatias dentárias/matrizes condutivas semeadas com DPSCs-shRNA foram implantadas em subcutâneo de dorso de camundongos imunodeprimidos por 28 dias e o número de vasos sanguíneos foi determinado por imunohistoquímica para eGFP e coloração por HE. β-catenina ativa foimais expressa em shRNA-LRP6 e shRNA-Frizzled6 que nas células controle, e sua expressão aumentou com a suplementação com rhVEGF165 e rhWnt1. A expressão de GSK3-β fosforilado foi menor, porém também aumenta ou permanece estável com rhVEGF165 ou rhWnt1. Quanto à expressão de VEGF, em shRNA-Frizzled6 foi maior que nas células controle e em shRNA-LRP6 (p<0,05), enquanto que a expressão de IL8 foi menor em shRNA-LRP6, diferindo estatisticamente das outras células. A expressão dos marcadores endoteliais CD31 eVEGFR2 diminuiu nas células shRNA-LRP6, enquanto que em shRNA Frizzled6a expressão de VEGFR2 foi aumentada. A formação de túbulos capilares de shRNA-Frizzled6 e shRNA-LRP6 foi menor quando comparado ao controle, porém shRNA-Frizzled6 obteve uma tendência de aumento na proliferação de capilares em 144h. In vivo, DPSC-shRNALRP6 apresentou menor número de capilares formados quando comparados com as outras duas células (p<0,05). Coletivamente, os resultados deste estudo sugerem que a via de sinalização Wnt/β-catenina regula a diferenciação...

The aim of this study was to evaluate the function of Wnt/β-cateninsignaling through LRP-6 and Frizzled-6 receptors in the differentiation ofdental pulp stem cells from permanent teeth (DPSC) into endothelial cells.DPSC were transduced with EGFP-tagged lentiviral shRNA vectors(LRP6, Frizzled6 or empty vector - control) for experiments. In vitro assayevaluated GSK3-β and β-catenin expression by western blot in rhWnt1and rhVEGF165 presence, and VEGF and CXCL-8 (IL-8) expression byELISA. Endothelial markers expression (western blot and PCR) and tubeformation were analyzed after endothelial differentiation of DPSCs. In vivo,tooth slices/scaffolds seeded with transduced DPSCs were implantedsubcutaneously in back of immunodefficient mice and blood vessels werecounted per immunohistochemistry for eGFP and HE staining. Active β-catenin was more expressed in shRNA-LRP6 and shRNA-Frizzled6 thanin control cells, and increased with rhVEGF165 and rhWnt1supplementation. Phosphorylated GSK3-β expression was lower, howeveralso increased or maintained with rhVEGF165 or rhWnt1. VEGF expressionwas higher in shRNA-Frizzled6 than in control and shRNA-LRP6 (p<0,05),IL8 expression was lower in shRNA-LRP6, with statistically difference ofthe others cells. Endothelial markers CD31 and VEGFR2 expressiondecreased in shRNA-LRP6, but VEGFR2 expression increased in shRNAFrizzled6.shRNA-Frizzled6 and shRNA-LRP6 tube formation was lowerwhen compared to control, however shRNA-Frizzled6 had tendency toincrease proliferation in 144h. In vivo, shRNA-LRP6 showed fewer bloodvessels formed than other cells (p<0,05). Collectively, the results of thisstudy suggest that Wnt/β-catenin signaling regulates endothelialdifferentiation of DPSC through LRP6.