Morphometric analysis of feedforward pathways from the primary somatosensory area (S1) of rats

We used biotinylated dextran amine (BDA) to anterogradely label individual axons projecting from primary somatosensory cortex (S1) to four different cortical areas in rats. A major goal was to determine whether axon terminals in these target areas shared morphometric similarities based on the shape of individual terminal arbors and the density of two bouton types: en passant (Bp) and terminaux (Bt). Evidence from tridimensional reconstructions of isolated axon terminal fragments (n=111) did support a degree of morphological heterogeneity establishing two broad groups of axon terminals. Morphological parameters associated with the complexity of terminal arbors and the proportion of beaded Bp vs stalked Bt were found to differ significantly in these two groups following a discriminant function statistical analysis across axon fragments. Interestingly, both groups occurred in all four target areas, possibly consistent with a commonality of presynaptic processing of tactile information. These findings lay the ground for additional work aiming to investigate synaptic function at the single bouton level and see how this might be associated with emerging properties in postsynaptic targets.

Use of nonradioactive labeling to detect large gene rearrangements in 21-hydroxylase deficiency

OBJETIVO: Padronizar a técnica de Southern blotting usando hibridização com material não radioativo para detectar grandes rearranjos no gene CYP21A2 em uma amostra da população brasileira com hiperplasia adrenal congênita. MÉTODO: Foram estudados 42 pacientes, 2 dos quais aparentados, totalizando 80 alelos não relacionados. As amostras de DNA foram obtidas de sangue periférico, digeridas com enzima de restrição Taq I, realizado Southern blotting e hibridizadas com sonda marcada com biotina. RESULTADOS: O método se mostrou eficaz, com resultados similares aos encontrados ao utilizar a metodologia com material radioativo. Foram encontradas 2,5% de deleção do CYP21A2, 8,8% de grandes conversões, 3,8% de deleção do CYP21A1P e 6,3% de duplicação do CYP21A1P. Estas freqüências foram similares às encontradas em nosso estudo prévio, onde um número significante de casos foi estudado. Um bom padrão de hibridização foi alcançado utilizando menor quantidade de DNA (5mg) e a emissão de sinais foi observada entre 5 minutos e 1 hora de exposição. CONCLUSÕES: Padronizamos uma técnica de Southern blotting/ hibridização com material não radioativo (biotina) para a pesquisa de grandes rearranjos no gene CYP21A2 com bons resultados. Apesar de ser mais trabalhoso, este método é mais rápido, utiliza menores quantidades de DNA e, principalmente, evita problemas com o uso de radioatividade.

Uso de sondas no radiactivas para la determinación del número de copias de genes y para el diagnóstico de enfermedades moleculares / Use of non radioactive probes to assess gene copy numbers and for the diagnosis of molecular diseases

Se sintetizó un análogo fotoactivable de biotina, el que se utilizó para marcar sondas de ácidos nucleicos. La marca se reveló con dos sistemas de detección avidina-peroxidasa y estreptavidina-fosfatasa alcalina, siendo ésta última la que demostró una mayor sensibilidad. Los plasmidos pSS1.8 y pSP64/U1 fueron fotobiotinilados y utilizados en ensayos de hibridación en gota con DNA extraido de leucocitos humanos. Despues de la incubacion con estreptavidina y fosfatasa alcalina biotinilada, la actividad de la enzima se reveló con un sustrato soluble. Los resultados obtenidos demuestran diferencias cuantitativas consistentes con el número de copias para globina y U1snRNA humano. El plasmido pSS1.8 fotobiotinilado se utilizó para identificar fragmentos de restricción de DNA genómico alterados en un paciente afectado de anemia de células falciformes. El gen de la globina mutado se detectó por digestión del DNA del paciente con la endonucleasa de restricción Dde I, seguido de una hibridación "Southern" con la sonda marcada