RESUMO
Introducción. No existen reportes sobre las variaciones en la secuencia de los genes blanco de los medicamentos anti- Toxoplasma en aislamientos provenientes de Suramérica. Objetivo. Clonar y secuenciar los genes de la dihidrofolato-reductasa ( dhfr ) y la dihidropteroato-sintetasa ( dhps ) de la cepa de referencia RH y de dos aislamientos colombianos de Toxoplasma gondii. Materiales y métodos. Se obtuvieron dos aislamientos de T. gondii en líquido céfalorraquídeo de pacientes colombianos positivos para HIV con toxoplasmosis cerebral. Se extrajo el ADN de los genes dhfr y dhps y se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los productos fueron clonados en el vector pGEM-T y secuenciados. Resultados. Se encontró un cambio de adenina por guanina (A « G) en la posición 235 del exón 2 del gen dhps , dos cambios de guanina por citocina (G « C) en las posiciones 259 y 260 y un cambio de timina por guanina (T « G) en la posición 371 del exón 4 del gen dhps. Por análisis bioinformático, en este último exón se identificó un polimorfismo no sinónimo en la región codificante, que podría llevar al cambio de una Glu (CAA o CAG) por una His (codificada por los codones AAU o AAC). Se calculó el modelo estructural de la enzima dihidropteroato-sintetasa (DHPS) de T. gondii y se identificaron las modificaciones en la estructura secundaria ocasionadas por las mutaciones. Conclusiones. La metodología estandarizada puede servir como base para la búsqueda de polimorfismos en muestras de pacientes con diferentes manifestaciones clínicas de toxoplasmosis y para establecer su posible relación con los cambios en la sensibilidad a los antifolatos y la reacción al tratamiento.
Introduction: There are no reports describing polymorphisms in target genes of anti- Toxoplasma drugs in South American isolates. Objective: This study sought to perform cloning and sequencing of the dihydrofolate reductase ( dhfr ) and dihydropteroate-synthase ( dhps ) genes of the reference Rh strain and two Colombian isolates of Toxoplasma gondii . Materials and methods: Two isolates were obtained from the cerebrospinal fluid of HIV-infected patients with cerebral toxoplasmosis. A DNA extraction technique and PCR assay for the dhfr and dhps genes were standardized, and the products of amplification were cloned into Escherichia coli and sequenced. Results: One polymorphism (A « G) was found at position 235 of exon 2 in the dhps gene. In addition, two polymorphisms (G « C) at positions 259 and 260 and one polymorphism (T « G) at position 371 within exon 4 of the dhps gene were detected. In this last exon, a bioinformatic analysis revealed a non-synonymous polymorphism in the coding region that could lead to the substitution of Glu (CAA or CAG) for His (encoded by codons AAU or AAC). A structural model of the T. gondii DHPS protein was calculated, and the results revealed modifications in secondary structure due to mutations. Conclusions: The methods described in this study can be used as a tool to search for polymorphisms in samples from patients with different clinical manifestations of toxoplasmosis and to examine their relationship with the therapeutic response.
Assuntos
Animais , Humanos , Masculino , Camundongos , Di-Hidropteroato Sintase/genética , Polimorfismo de Nucleotídeo Único , Proteínas de Protozoários/genética , Tetra-Hidrofolato Desidrogenase/genética , Toxoplasma/enzimologia , Infecções Oportunistas Relacionadas com a AIDS/líquido cefalorraquidiano , Infecções Oportunistas Relacionadas com a AIDS/parasitologia , Substituição de Aminoácidos , Sequência de Bases , Clonagem Molecular , Colômbia , Líquido Cefalorraquidiano/parasitologia , DNA de Protozoário/genética , DNA Recombinante/genética , Di-Hidropteroato Sintase/química , Éxons/genética , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Conformação Proteica , Proteínas de Protozoários/química , Alinhamento de Sequência , Homologia de Sequência do Ácido Nucleico , Toxoplasma/genética , Toxoplasma/isolamento & purificação , Toxoplasmose Animal/parasitologia , Toxoplasmose Cerebral/líquido cefalorraquidiano , Toxoplasmose Cerebral/parasitologiaRESUMO
OBJETIVO: Caracterizar el ambiente genómico de las secuencias adyacentes al virus linfotrópico humano de células T tipo 1 (HTLV-1) en pacientes con paraparesia espßstica tropical y mielopatía asociada a la infección con HTLV-1 (PET/MAH) de diferentes regiones de Colombia y del Japón. MÉTODOS: Se enfrentaron 71 clones recombinantes con secuencias del genoma humano adyacentes al 5'-LTR de pacientes con PET/MAH, a las bases de datos del Genome Browser y del Gen-Bank. Se identificaron y analizaron estadísticamente 16 variables genómicas estructurales y composicionales mediante el programa informßtico R, versión 2.8.1, en una ventana de 0,5 Mb. RESULTADOS: El 43,0 por ciento de los provirus se localizaron en los cromosomas del grupo C; 74 por ciento de las secuencias se ubicaron en regiones teloméricas y subteloméricas (P < 0,05). Un anßlisis de conglomerados permitió establecer las relaciones jerßrquicas entre las características genómicas incluidas en el estudio; el anßlisis de componentes principales identificó las componentes que definieron los ambientes genómicos preferidos para la integración proviral en casos de PET/MAH. CONCLUSIONES: El HTLV-1 se integró con mayor frecuencia en regiones de la cromatina ricas en islas de citocina fosfato guanina (CpG), de alta densidad de genes y de repeticiones tipo LINE (elemento disperso largo [long interspersed element]) y transposones de ADN que, en conjunto, conformarían los ambientes genómicos blanco de integración. Este nuevo escenario promoverß cambios sustanciales en el campo de la salud pública y en el manejo epidemiológico de las enfermedades infecciosas, y permitirß desarrollar potentes herramientas para incrementar la eficiencia de la vigilancia epidemiológica.
OBJECTIVE: Characterize the genomic environment of the sequences adjacent to human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) in patients with HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) in different regions of Colombia and Japan. METHODS: A total of 71 recombinant clones with human genome sequences adjacent to 5' LTR in patients with HAM/TSP were compared to the Genome Browser and GenBank databases. Sixteen structural and compositional genome variables were identified, and statistical analysis was conducted in the R computer program, version 2.8.1, in a 0.5 Mb window. RESULTS: A total of 43.0 percent of the proviruses were located in the group C chromosomes; 74 percent of the sequences were located in the telomeric and subtelomeric regions (P < 0.05). A cluster analysis was used to establish the hierarchical relations between the genome characteristics included in the study. The analysis of principal components identified the components that defined the preferred genome environments for proviral integration in cases of HAM/TSP. CONCLUSIONS: HTLV-1 was integrated more often in chromatin regions rich in CpG islands with a high density of genes and LINE type repetitions, and DNA transposons which, overall, would form the genomic environments targeted for integration. This new scenario will promote substantial changes in the field of public health and in epidemiological management of infectious diseases. It will also foster the development of powerful tools for increasing the efficiency of epidemiological surveillance.
Assuntos
Adulto , Idoso , Feminino , Humanos , Masculino , Pessoa de Meia-Idade , Genoma Humano , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/genética , Paraparesia Espástica Tropical/genética , Provírus/genética , Sequências Repetidas Terminais/genética , Integração Viral/genética , Mapeamento Cromossômico , Cromossomos Humanos/genética , Colômbia/epidemiologia , Ilhas de CpG , DNA Recombinante/genética , Paraparesia Espástica Tropical/epidemiologia , Paraparesia Espástica Tropical/virologia , Retroelementos/genética , Alinhamento de Sequência , Análise de Sequência de DNA , Homologia de Sequência do Ácido NucleicoRESUMO
La patología comparada resurge como el punto de encuentro entre el patrón de estudio morfológico humano y el animal. Su aplicación desde sus inicios se apoyó en los biomodelos animales, muchos de los cuales se lograron por manipulación genética. Estos métodos de estudio fueron generados a partir del comportamiento de la enfermedad en el humano. La ingeniería genética se refiere a tecnología desarrollada por el manejo del ADN recombinante, definida por ser una secuencia nueva de ADN creada en los laboratorios por la unión de porciones de ADN con orígenes diferentes. A un organismo cuyo material genético ha sido modificado artificialmente mediante la supresión de expresiones génicas o la incorporación de fracciones o secuencias de ADN ajeno a su especie, se le llama organismo genéticamente modificado (OGM); organismo modificado genéticamente (OMG) o simplemente transgénico (antes, transgenético). La ingeniería genética se define como el conjunto de técnicas y métodos que se utilizan para construir moléculas de ADN recombinante y luego introducirlas en moléculas receptoras. En Venezuela existe una prohibición para la manipulación en animales. Se aplican la Ley de Biodiversidad, el Convenio de Diversidad biológica y el Protocolo Internacional de Biodiversidad. Con la investigación animal, los científicos han descubierto las maneras de salvar y prolongar la vida humana. Vacunaciones tales como la poliomielitis trasplantes de órganos perfeccionados así como el desarrollo de técnicas quirúrgicas y de traumatología reconstructivas. De manera activa se ha generado un debate por el uso de animales en la investigación y en los ensayos biotecnológica. Se plantea la bioética en la aplicación de los biomodelos animales. Es importante el conocimiento de estos métodos de investigación genética en animales de investigación, más aún en instituciones generadoras de productos biológicos. En poco tiempo se ha generado un fenómeno transgénico de la...
Assuntos
Humanos , Animais , DNA Recombinante/genética , Anatomia Comparada/métodos , Animais Geneticamente Modificados/anatomia & histologia , Animais Geneticamente Modificados/genética , Cuidados para Prolongar a Vida/métodosRESUMO
Homocystinuria is a metabolic disorder caused by a deficiency of cystathionine b-synthase (CBS). The major clinical symptoms of this disease are mental retardation, lens dislocation, vascular disease with life-threatening thromboembolisms, and skeletal deformities. The major treatments for CBS deficiency include pharmacologic doses of pyridoxine or dietary restriction of methionine. There is currently no effective long-term treatment to lower the elevated plasma levels of homocysteine. However, gene therapy could be an effective novel approach for the treatment of homocystinuria. A recombinant adeno- associated virus vector carrying human CBS cDNA (rAAV-hCBS) was constructed and administered to CBS-/- mice by intramuscular (IM) and intraperitoneal (IP) injections. Serum homocysteine concentrations significantly decreased in treated mice compared with age-matched controls two weeks after treatment. The treated CBS-/- mice had life spans 3-7 days longer compared with untreated CBS-/- mice. In CBS-/- mice treated with rAAV-hCBS via IP injection, the vector was detected in all organs examined including liver, spleen, and kidney, and CBS gene expression was observed by immunohistochemical staining in the liver. These results indicate the efficacy of gene delivery and demonstrate the possibility of gene therapy mediated by AAV gene transfer in this mouse model of homocystinuria.
Assuntos
Camundongos , Humanos , Animais , Taxa de Sobrevida , Imuno-Histoquímica , Homocistinúria/enzimologia , Homocisteína/sangue , Técnicas de Transferência de Genes , Terapia Genética , Modelos Animais de Doenças , Dependovirus/genética , DNA Recombinante/genética , Cistationina beta-Sintase/genética , Linhagem CelularRESUMO
El advenimiento de las técnicas de DNA recombinante abrió una nueva era en los estudios genéticos. Por primera vez se hizo posible aislar, amplificar e incluso manipular segmentos de DNA de genes individuales. Estos métodos, junto con herramientas poderosas como los métodos de secuenciación, reacción en cadena de la polimerasa y el chips de DNA, han permitido el conocimiento de la estructura, función y regulación de los genes. Actualmente, las técnicas del DNA recombinante tienen muchas aplicaciones importantes, entre las que destacan la localización y clonación de genes responsables de enfermedades, lo que permite su diagnóstico molecular y la identificación precisa de individuos a través de sus huellas genómicas. Además, esta metodología ha permitido la producción comercial de genes y proteínas mediante ingeniería genética para su empleo en medicina y la creación de animales transgénicos
Assuntos
DNA Recombinante/genética , DNA Recombinante , Análise de Sequência/métodos , Análise de Sequência , Clonagem Molecular/métodos , Hibridização de Ácido Nucleico/genética , Oligonucleotídeos Antissenso/administração & dosagem , Oligonucleotídeos Antissenso/uso terapêutico , Biologia Molecular , Biologia Molecular/tendências , Biblioteca GenômicaAssuntos
Humanos , DNA Recombinante/genética , DNA/fisiologia , Replicação do DNA/fisiologia , Transcrição Gênica/fisiologia , Aminoácidos/genética , Código Genético/fisiologia , Genética Médica/educação , Ligação Proteica/fisiologia , Proteínas/genética , RNA de Transferência/fisiologia , Transdução Genética/fisiologiaRESUMO
E coli genomic DNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using two 5' and 3' oligonucleotide primers (27-mer). Amplified DNA was 191 bp. The region of amplified DNA on lac operon in E coli was 14 bp upstream from the transcription initiation site and 177 bp downstream. Amplified DNA was cloned into a phagemid vector for construction of plasmid, suitable for use as template for making strand-specific probe to detect initiated lac transcript by RNase protection assay, labelling for Southern and Northern hybridization. Another use of this probe made from this construct is to detect strand-specific DNA repair. The construct was verified by DNA sequencing.
Assuntos
Proteínas de Bactérias/genética , Sequência de Bases , Clonagem Molecular , DNA Recombinante/genética , Escherichia coli/genética , Proteínas de Escherichia coli , Dados de Sequência Molecular , Plasmídeos , Reação em Cadeia da Polimerase , Regiões Promotoras Genéticas , Proteínas Repressoras/genéticaRESUMO
Amebiasis is one of the main causes worldwide of morbidity and mortality by parasites. Application of recombinant DNA technology to the study of Entamoeba histolytica is bringing new light into our understanding of this remarkable protozoan parasite and of the disease it causes. New achievements affect the way we approach many essential questions about E. histolytica, form the mechanism of its pathogenicity to the definition of E. hitolytica as a separate species from the nonpathogenic E. dispar. To give a single example, transfection of trophozoites is now possible and a new generation of studies taking advantage of this capability of manipulation is expected in the short term. Our goal with this review is to provide an updated and simple guide to the growing information on the molecular biology of E. histolytica
Assuntos
Amebíase/microbiologia , DNA Recombinante/genética , Entamoeba histolytica/citologia , Genoma , Biologia MolecularRESUMO
En la última década el enorme desarrollo de la biología molecular ha posibilitado que la tecnología del DNA recombinante se aplique a la transferencia de genes con fines terapéuticos, pasando del sueño a la realidad. Los sistemas de vectorización de los diferentes genes incluyen, a los retrovirus, adenovirus, herpesvirus, lipososmas, etc., cada uno con ventajas y desventajas, de acuerdo con la enfermedad a ser tratada y con el tejido objeto de la corrección genética. Hasta el momento aproximadamente 80 protocolos clínicos están siendo aplicados en el mundo y su número auemnta día a día. El control y regulación de la aplicación de estos protocolos implica la evaluación rigurosa de cada uno de ellos, tanto en modelos in vitro como en animales, antes de su aplicación final en el hombre. El país debe prepararse tanto científica y tecnológicamente como desde el punto de vista ético y legal, para enfrentar los retos de este nuevo enfoque terapéutico.
Assuntos
Humanos , Animais , DNA Recombinante , DNA Recombinante/genética , DNA Recombinante/uso terapêutico , Técnicas de Transferência de Genes/estatística & dados numéricos , Vetores Genéticos , Biologia MolecularRESUMO
Microbial production of L-tyrosine by direct fermentation and by enzymatic methods has been reviewed. Achievements in this regard made through recombinant DNA techniques have also been included. The review also includes biosynthesis and regulation of tyrosine.
Assuntos
Bacillus subtilis/genética , Carbono/metabolismo , DNA Recombinante/genética , Enzimas/química , Escherichia coli/genética , Fermentação , Mutação/genética , Estereoisomerismo , Tirosina/biossínteseAssuntos
História do Século XIX , DNA Recombinante/genética , DNA Recombinante/história , DNA Recombinante/imunologia , DNA Recombinante/fisiologia , Genética Médica/história , Genética/história , Engenharia Genética/história , Interleucina-1/genética , Interleucina-1/história , Interleucina-1/imunologia , Interleucina-1/fisiologiaRESUMO
A Plasmodium falciparum genomic DNA library was established in the expression vector lambda gt11, cloned in Escherichia coli. The library was screened with human hyperimmune sera by in situ hybridization. Twenty clones expressing P. falciparum sequences as polypeptides fused to beta-galactosidase were identified. One, CD3A/9025/60, reacted with all immune sera and expressed polypeptides that were larger than beta-galactosidase as well as reacting with antibodies to beta-galactosidase and to P. falciparum. When the fusion proteins were used as target antigens to diagnose malaria antibodies, a result was obtained which correlated well with indirect fluorescence assay.
Assuntos
Animais , Antígenos de Protozoários/genética , Clonagem Molecular/métodos , DNA Recombinante/genética , Estudos de Avaliação como Assunto , Genes de Protozoários/genética , Biblioteca Genômica , Humanos , Malária Falciparum/diagnóstico , Plasmodium falciparum/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/análise , Testes Sorológicos/métodosRESUMO
Neonatal BALB/c mice were inoculated (ip) with a recombinant Moloney murine leukemia virus-TB. Majority of the inoculated mice developed lymphoma within 5-7 months post infection. The cells from splenic lymphomas were cultured and 3 continuous cell lines (GP1, GP2 and GP3) developed. GP1 was single cell cloned and characterized. Based on Thy 1.2 (98.4%) phenotypic marker, the cell line was categorized as T cell line. The percent positivity for different cell surface markers on analysis with FACS was 98.4, 4.8, 5.5, 2.2, 1.8, 1.2 and 9.5 for Thy 1.2, mu, L3T4, Lyt2, Ia, IL2R and PNA receptor, respectively. A total of 16.5% GP1 cells was also positive for Moloney murine leukemia virus envelope protein (gp 70). Incomplete retrovirus like particles were demonstrated in the cytoplasm of GP1 cells by electron microscopy. The cell line on inoculation(ip) in neonatal BALB/c mice produced lymphomic lesions in almost all the vital organs of the mice.
Assuntos
Animais , DNA Recombinante/genética , Tecido Linfoide/microbiologia , Linfoma de Células T/microbiologia , Camundongos , Camundongos Endogâmicos BALB C , Vírus da Leucemia Murina de Moloney/isolamento & purificação , Transplante de Neoplasias , Células-Tronco Neoplásicas/patologia , Baço/patologia , Linfócitos T/patologia , Células Tumorais Cultivadas/citologia , VirulênciaRESUMO
Os avanços da biologia molecular e o emprego de técnicas de identificaçäo de porçöes de DNA codificadoras para proteínas importantes na síntese, armazenamento, transporte e açäo periférica dos hormônios tireoideos, permitiram a elucidaçäo, a nivel molecular, da etiologia de várias condiçöes genéticas da tireóide. Em pacientes com defeito na peroxidase tireóidea (TPO) observou-se a presença de polimorfismo (RFLP) com a endonuclease Bgl-I que se segrega, em 2 alelos, com o fenótipo com bócio, hipotireoidismo e teste de perclorato positivo. Em defeitos da tireoglobulina (Tg), observou-se nível quantitativamente baixo de Tg, concomitante com a virtual ausência da RNA mensageiro para a Ig. Por outro lado, a ausência de incorporaçäo de ácido siálico na molécula de Tg, produz proteína com defeito estrutural que impede a síntese adequada de T3 e T4. Tais defeitos da Tg säo igualmente encontrados em animais com bócio congênito (gados bovino e caprino, e camundongos cog/cog). A presença de mutaçäo puntiforme no nucleotídeo 281 do exon 5 do RNA da globulina carreadora de T4 (TBG) leva a expressäo genética de proteína instável, com queda da TBG sérica. O efeito nos receptores nucleares de T3 estäo ligados ao gene codificador (c-erb-A-beta) localizado no cormossoma 3. A presença de polimorfismo EcorRV nos indivíduos, sugere gene mutante codificando proteína que poderia näo fixar T3 ou produzir proteína anômala com atividade bloqueadora da açäo de T3 impedindo a fixaçäo nuclear
Assuntos
Humanos , Animais , Hormônios Tireóideos/genética , Biologia Molecular , Clonagem Molecular , DNA Recombinante/genética , DNA Recombinante/metabolismo , Biblioteca Genômica , Hipotireoidismo/genética , Hipotireoidismo/metabolismo , Iodeto Peroxidase/genética , Iodeto Peroxidase/metabolismo , Receptores dos Hormônios Tireóideos/genética , Tireoglobulina/genética , Tireoglobulina/metabolismoRESUMO
A fermentaçäo industrial tem recebido, ultimamente, grande impulso, graças às novas técnicas genéticas disponíveis que permitem modificar o patrimônio genético de um microrganismo para que possa ser utilizado mais eficientemente, ou ainda, de modo mais inédito, para fabricar produtos novos que näo podiam ser obtidos por fermentaçäo. Diversos exemplos säo mencionados (ênzimos, antibióticos, proteínas, aminoácidos, entre outros), para ilustrar as enormes potencialidades do melhoramento genético e da engenharia genética como ferramentas valiosíssimas para a indústria de fermentaçöes e säo discutidos os principais problemas oriundos da utilizaçäo desses microrganismos modificados no processo fermentativo
Assuntos
Fermentação , Engenharia Genética , Microbiologia Industrial , Ácido Ascórbico/biossíntese , Aminoácidos/biossíntese , Antibacterianos/biossíntese , Clonagem Molecular , DNA Recombinante/genética , Etanol , Genes Bacterianos , Proteínas de Bactérias/biossíntese , Proteínas de Bactérias/genéticaRESUMO
La biología ha evolucionado al grado que hoy sus métodos de análisis son a nivel molecular. Derivado de este conocimiento se han desarrollado tecnologías altamente sofisticadas; una de ellas es la tecnología de ADN recombinante, la que permite manipular in vitro la información contenida en el genoma de una célula. Una de sus aplicaciones es en el diagnóstico clínico para la detección de agentes patógenos y/o condiciones particulares del material genético que derivan en una patología determinada