Molecular diagnosis and genotyping of Dienlamoeba fragilis by polymerase chain reaction compared to microscopy and culture

The diagnosis of D. fragilis by microscopic identification of the parasite in stool is time consuming and relatively insensitive. To evaluate microscopy, culture and PCR for detection of D. fragilis in stool samples and to identify the genotypes of D. fragilis isolates among the study population. A total of 82 fresh human fecal samples were examined by microscopy using Wheatley's trichrome permanent staining, culture using the modified Boeck and Drbohlav medium and PCR targeting the small subunit [SSU] rRNA gene. Additionally, the existence of genetic variation among D. fragilis isolates [proved positive by PCR] was examined by restriction fragment length polymorphism analysis. PCR detected 25 isolates [30.5%], MBD culture detected 24 isolates [29.3%], while microscopy detected 8 isolates [9.8%]. Sensitivities of PCR, culture and microscopy were 92.6%, 88.9% and 29.6%, respectively. The agreement between PCR and culture results was substantial [KA=0.86]. PCR followed by RFLP analysis revealed the existence of two genetic variants among 25 D. fragilis isolates. Genotype I predominated in 23 [92%] samples, while the remaining two isolates corresponded to genotype II. It is recommended to use culture for routine diagnosis of D. fragilis in suspected gastrointestinal cases. Two genetic variants of D. fragilis existed in the Egyptian isolates

Detección molecular de Dientamoeba fragilis en heces: eliminación de los inhibidores de la DNA polimerasa / Molecular detection of Dientamoeba fragilis in faeces: removal of DNA polymerase inhibitors

Se realizó un estudio de purificación del DNA de los trofozoitos de Dientamoeba fragilis a partir de muestras fecales humanas congeladas, no fijadas en formol, y con elevadas concentraciones de inhibidores de la DNA polimerasa. Para tal fin, se utilizaron columnas ("spin-columns") disponibles en el comercio. Esta metodología se comparó con una técnica tradicional de purificación con fenol/cloroformo. Ambos métodos fueron seguidos de la amplificación del DNA de D. fragilis por una "nested" PCR y posterior electroforesis en un gel de agarosa de los amplicones obtenidos. La extracción del DNA a partir de trofozoitos de D. fragilis - mediante el procedimiento de las columnas - produjo DNA de elevada calidad, libre de impurezas e inhibidores de la polimerasa. Por el contrario, con la técnica de fenol/cloroformo se observó la inhibición de la enzima, cuando se analizaron los productos de amplificación. Además, se confirmó que el agregado de SAF (solución de acetato de sodio - ácido acético - formol) a las muestras fecales afecta la integridad del DNA y como consecuencia impide su posterior amplificación.