Identificación de especies de Leishmania en pacientes derivados al Instituto Nacional de Salud del Perú / Identification of Leishmania species in patients derived to the National Institute of Health, Peru

RESUMEN En el Perú, la leishmaniasis es una enfermedad metaxénica que representa un serio problema de salud pública, debido a su amplia distribución y al número de personas en riesgo de contraer la enfermedad, siendo la población vulnerable principalmente las personas de bajos recursos económicos. El estudio se realizó a partir de pacientes que fueron derivados al Instituto Nacional de Salud entre el 2006 y el 2011 para que se les realizara el diagnóstico especializado. La identificación de la especie de Leishmania infectante se desarrolló mediante el análisis de las curvas de disociación (HRMA) obtenidas a partir del ADN genómico de promastigotes y amastigotes, lo que permitió identificar las especies de Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) peruviana como las más prevalentes, además de Leishmania (V.) lainsoni y Leishmania (L.) amazonensis.

ABSTRACT In Peru, leishmaniasis is a metaxenic disease that represents a serious public health problem, due to its wide distribution and the number of people in danger of contracting the disease, being the vulnerable population mainly those with low economic resources. The study was conducted from patients who were derived to Peru's National Institute of Health between 2006 and 2011 so that the specialized diagnosis could be carried out. The identification of the species of infectious Leishmania was developed through the analysis of the High-Resolution Melting Analysis obtained from the genomic DNA of promastigotes and amastigotes, which allows to identify the species of Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) peruviana as more prevalent, in addition to Leishmania (V.) lainsoni and Leishmania (L.) amazonensis.

Serological study of feline leishmaniasis and molecular detection of Leishmania infantum and Leishmania braziliensis in cats (Felis catus) / Pesquisa sorológica da leishmaniose felina e detecção molecular de Leishmania infantum e Leishmania braziliensis em gatos (Felis catus)

Abstract Blood samples and swabs from ocular conjunctiva and mouth were obtained from 64 cats. Of 64 serum samples, 19 were positive for Leishmania antibodies by ELISA (29.80%). Eight cats were positive by PCR (12.5%) in swab samples from mouth and/or ocular mucosa. Poor kappa agreement between serological and molecular results (k = 0.16) was obtained. From five positive PCR samples one was L. braziliensis and four were L. infantum. Phylogenetic analysis performed with the five isolates of Leishmania, showed that samples of L. infantum isolated from the cats were phylogenetically close to those isolated from domestic dogs in Brazil, while the L. braziliensis is very similar to the one described in humans in Venezuela. The study demonstrated that, despite high seropositivity for Leishmania in cats living in the study region, poor agreement between serological and molecular results indicate that positive serology is not indicative of Leishmania infection in cats. Parasite DNA can be detected in ocular conjunctiva and oral swabs from cats, indicating that such samples could be used for diagnosis. Results of phylogenetic analyzes show that L. infantum circulating in Brazil is capable of infecting different hosts, demonstrating the parasite's ability to overcome the interspecies barrier.

Resumo Amostras de sangue e swabs da conjuntiva ocular e oral foram obtidas de 64 gatos. Das 64 amostras de soro, 19 foram positivas para anticorpos contra Leishmania por ELISA (29,80%). Oito gatos foram positivos por PCR (12,5%) em amostras de swab da boca e / ou mucosa ocular. Demonstrou-se baixa concordância kappa entre os resultados sorológicos e moleculares (k = 0,16). Das cinco amostras positivas para PCR, uma era L. braziliensis e quatro eram L infantum. A análise filogenética realizada com os cinco isolados de Leishmania, mostrou que amostras de L. infantum, isoladas dos gatos, eram filogeneticamente próximas às isoladas de cães domésticos do Brasil enquanto L. braziliensis era muito semelhante ao descrito em humanos na Venezuela. O estudo demonstrou que, apesar da alta soropositividade para Leishmania, em gatos que vivem na região do estudo, pouca concordância entre os resultados sorológicos e moleculares indica que a sorologia positiva não é indicativa de infecção por Leishmania em gatos. O DNA do parasita pode ser detectado na conjuntiva ocular e nas zaragatoas orais de gatos, indicando que essas amostras podem ser usadas para o diagnóstico. . Resultados de análises filogenéticas mostram que L. infantum, circulando no Brasil, é capaz de infectar diferentes hospedeiros, demonstrando a capacidade do parasita de superar a barreira interespécies.

Geographical distribution of Leishmania species in Colombia, 1985-2017 / Distribución geográfica de las especies de Leishmania en Colombia, 1985-2017

Abstract Introduction: Knowledge of the geographical distribution of Leishmania species allows guiding the sampling to little-studied areas and implementing strategies to define risk zones and priority areas for control. Objective: Given that there is no publication that collects this information, the search, review, and compilation of the available scientific literature that has identified species in Colombia is presented in this paper. Materials and methods: A bibliographic search was performed in PubMed, Web of Knowledge, Google Scholar, SciELO and LILACS with the terms "(Leishmania OR Leishmaniasis) AND species AND Colombia", without restrictions on publication year, language or infected organism; records of national scientific events and repositories of theses from Colombian universities were also included. Results: Eighty-six scientific documents published between 1985 and 2017 were found in which the species of Leishmania and their geographical origin were indicated. The species reported, in descending order of frequency, were: Leishmania (Viannia) panamensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (Leishmania) infantum, L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana, L. (V.) colombiensis, L. (V.) lainsoni and L. (V.) equatorensis; the last three were found with the same frequency. Leishmania species were reported from 29 departments. Conclusion: Information on the distribution of Leishmania species in Colombia is limited; therefore, it is necessary to gather existing data and propose studies that consolidate the distribution maps of Leishmania species in Colombia. This would allow the detection of areas where species have not been identified as well as the comparison of existing parasite and vector distributions.

Resumen Introducción. El conocimiento de la distribución geográfica de las especies de Leishmania permite orientar el muestreo hacia áreas poco estudiadas e implementar estrategias para detectar zonas de riesgo y áreas prioritarias de control. Objetivo. Dado que no existe una publicación que reúna esta información, se planteó la revisión y compilación de la literatura científica disponible de estudios de identificación de especies del país. Materiales y métodos. Se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica en PubMed, Web of Knowledge, Google Académico, SciELO y Lilacs con los términos "(Leishmania OR Leishmaniasis) AND especie AND Colombia", así como en memorias de eventos científicos nacionales y repositorios de tesis y trabajos de grado de universidades del país. Resultados. Se encontraron 86 documentos científicos publicados entre 1985 y 2017, en los cuales se informaron la especie de Leishmania y el origen geográfico. Las especies circulantes reportadas, en su orden de frecuencia, fueron: Leishmania (Viannia) panamensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (Leishmania) infantum, L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana, L. (V.) colombiensis, L. (V.) lainsoni y L. (V.) equatorensis, las últimas tres, con igual frecuencia. Los reportes proceden de 29 departamentos. Conclusión. La información de la distribución de las especies de Leishmania en Colombia es limitada. Por lo tanto, se necesita reunir los datos existentes y plantear trabajos que permitan consolidar el mapa de distribución de las especies en el país, lo cual permitiría detectar las zonas sin información de las especies circulantes y establecer la concordancia entre su distribución y la de los vectores.

Alterations induced in the ileum of mice upon inoculation with different species of Leishmania: a preliminary study

Abstract INTRODUCTION: Leishmania species cause skin, mucosal, and disseminated lesions. We studied the effects of three Leishmania species on ileal morphology in mice. METHODS: BALB/c mice were intraperitoneally inoculated with Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, and Leishmania (Leishmania) major (4 animals/group). After 72h, the ilea were collected and histologically processed. RESULTS: Following inoculation, the goblet cell and intraepithelial lymphocyte populations increased, while Paneth cell number and crypt width decreased. In addition, enterocyte size, villi height, and mucosa, submucosa, and muscular tunic thickness increased. CONCLUSIONS: Leishmania modified the quantity of cells in and morphology of mice ilea.

An atypical Toxoplasma gondii genotype in a rural Brazilian dog co-infected with Leishmania (Viannia) braziliensis

Toxoplasmosis and leishmaniasis are two worldwide zoonoses caused by the protozoan parasites Toxoplasma gondii and Leishmania spp., respectively. This report describes the clinical and laboratorial findings of a co-infection with both parasites in a 4-year-old female dog suspected of ehrlichiosis that presented anemia, thrombocytopenia, hypoalbuminemia, hyperglobulinemia, tachyzoite-like structures to the lung imprints, and polymerase chain reaction (PCR) results positive for T. gondii (kidney, lung, and liver) and Leishmania spp. Co-infection with Toxoplasma gondii and Leishmania braziliensis was confirmed by sequencing; restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction (RFLP-PCR) confirmed an atypical T. gondii genotype circulating in dogs that has been reported to cause human congenital toxoplasmosis.

Animal models frr the study of leishmaniasis immunolggy / Modelos animales para el estudio de la inmunologia de la leishmaniosis

Leishmaniasis remains a major public health problem worldwide and is classified as Category I by the TDR/WHO, mainly due to the absence of control. Many experimental models like rodents, dogs and monkeys have been developed, each with specific features, in order to characterize the immune response to Leishmania species, but none reproduces the pathology observed in human disease. Conflicting data may arise in part because different parasite strains or species are being examined, different tissue targets (mice footpad, ear, or base of tail) are being infected, and different numbers (“low” 1×102 and “high” 1×106) of metacyclic promastigotes have been inoculated. Recently, new approaches have been proposed to provide more meaningful data regarding the host response and pathogenesis that parallels human disease. The use of sand fly saliva and low numbers of parasites in experimental infections has led to mimic natural transmission and find new molecules and immune mechanisms which should be considered when designing vaccines and control strategies. Moreover, the use of wild rodents as experimental models has been proposed as a good alternative for studying the host-pathogen relationships and for testing candidate vaccines. To date, using natural reservoirs to study Leishmania infection has been challenging because immunologic reagents for use in wild rodents are lacking. This review discusses the principal immunological findings against Leishmania infection in different animal models highlighting the importance of using experimental conditions similar to natural transmission and reservoir species as experimental models to study the immunopathology of the disease.

Las leishmaniosis siguen siendo un importante problema de salud pública a nivel mundial y se clasifican como categoría I por el programa TDR/WHO, debido principalmente a la ausencia de control. Muchos modelos experimentales tales como roedores, perros y monos han sido desarrollados, cada uno con características específicas, para caracterizar la respuesta inmune a las diferentes especies de Leishmania, sin embargo ninguno reproduce la patología observada en la enfermedad humana. La diversidad en los resultados obtenidos podría deberse en parte a que diferentes cepas de parásitos o especies están siendo examinadas, diferentes tejidos (cojinete plantar, oreja o base de la cola) han sido infectados y diferente número (“bajo” 1×102 y “alto” 1×106) de promastigotes metacíclicos han sido inoculados. Recientemente, nuevos enfoques han sido propuestos con el fin de obtener datos más significativos en cuanto a la respuesta inmune del huésped y a la patogénesis, de tal forma que reproduzcan lo que ocurre en la enfermedad humana. El uso de la saliva del insecto y de un número de parásitos menor en las infecciones experimentales ha permitido reproducir la transmisión natural, identificar nuevas moléculas, así como mecanismos inmunes que deberían ser considerados en el diseño de vacunas y estrategias de control. Adicionalmente, se ha propuesto como una buena alternativa el uso de roedores silvestres como modelos experimentales tanto para el estudio de las relaciones huésped-patógeno como para probar nuevas vacunas. A la fecha, el uso de reservorios naturales para estudiar la infección por Leishmania ha sido un reto, debido a la carencia de reactivos inmunológicos para uso en roedores silvestres. Esta revisión describe los principales hallazgos inmunológicos ante la infección por Leishmania, en los diferentes modelos animales, destacando la importancia del uso de condiciones experimentales similares a la transmisión natural y de reservorios como modelos experimentales para el estudio de la inmunopatología de la enfermedad.

Leishmaniasis transmission: distribution and coarse-resolution ecology of two vectors and two parasites in Egypt

Introduction: In past decades, leishmaniasis burden has been low across Egypt; however, changing environment and land use has placed several parts of the country at risk. As a consequence, leishmaniasis has become a particularly difficult health problem, both for local inhabitants and for multinational military personnel. Methods: To evaluate coarse-resolution aspects of the ecology of leishmaniasis transmission, collection records for sandflies and Leishmania species were obtained from diverse sources. To characterize environmental variation across the country, we used multitemporal Land Surface Temperature (LST) and Normalized Difference Vegetation Index (NDVI) data from the Moderate Resolution Imaging Spectroradiometer (MODIS) for 2005-2011. Ecological niche models were generated using MaxEnt, and results were analyzed using background similarity tests to assess whether associations among vectors and parasites (i.e., niche similarity) can be detected across broad geographic regions. Results: We found niche similarity only between one vector species and its corresponding parasite species (i.e., Phlebotomus papatasi with Leishmania major), suggesting that geographic ranges of zoonotic cutaneous leishmaniasis and its potential vector may overlap, but under distinct environmental associations. Other associations (e.g., P. sergenti with L. major) were not supported. Mapping suitable areas for each species suggested that northeastern Egypt is particularly at risk because both parasites have potential to circulate. Conclusions: Ecological niche modeling approaches can be used as a first-pass assessment of vector-parasite interactions, offering useful insights into constraints on the geography of transmission patterns of leishmaniasis. .

Estudo da associação de micronutrientes ( zinco, cobre e ferro) na infecção, e ou progressão para leishmaniose tegumentar em duas comunidades rurais do Estado da Bahia / Study of micronutrients Association (zinc, copper and iron) in infection and or progression to cutaneous leishmaniasis in two rural communities in the state of Bahia

A leishmaniose tegumentar (LT) é um problema de saúde pública nas Américas, não somente por sua alta incidência e ampla distribuição geográfica, mas também, pela possibilidade de produzir úlceras persistentes e desfigurantes. É endêmica no Brasil, ocorrendo em ambientes florestais e extraflorestais. A detecção de áreas de alto risco para a infecção humana pode auxiliar na implementação de estratégias de controle mais eficientes nas áreas endêmicas rurais. Objetivos: descrever as características epidemiológicas, prevalência da infecção por Leishmania ssp nas populações do povoado de São Gonçalo/Contendas do Sinçorá - Bahia e no Distritode Florestal/Município de Jequié, Bahia, correlacionando os fatores de risco estabelecidos na literatura com os diferentes grupos estudados (indivíduos infectados, não infectados, e doentes) e avaliar a influencia da desnutrição na infecção e ou progressão para a doença, para isso, foram avaliados parâmetros bioquímicos como dosagem de fosfatase alcalina e ferritina, além dos níveis de metais Zn, Cu e Fe no plasma dos indivíduos.Material e Métodos - desenvolveu-se um estudo de corte transversal, através de inquérito epidemiológico, e imunoalérgico (exames intradermorreação de Montenegro/IDRM, e sorológico/ELISA). Foram cadastradas 36 famílias (170 indivíduos) de São Gonçalo e 129 famílias (480 indivíduos) de Florestal...

The cutaneous leishmaniasis (CL) is a public health problem in the Americas, not only for its high incidence and wide geographical distribution, but also by the possibility of establishing persistent and disfiguring ulcers. It is endemic in Brazil, occurring in forest and around environments. The detection of high-risk areas for human infection may assist in implementing strategies for more efficient control in rural endemic areas. Objectives -.This study aimed to describe the epidemiological characteristics, prevalence of Leishmania spp, infection in populations of São Gonçalo a rural communities/Contendas do Sincorá - Bahia and Florestal (District/Jequié, Bahia), correlating risk factors established in the literature with different groups studied (infected individuals not infected, and patients) and assess the influence of malnutrition on infection and progression for disease, for that biochemical parameters will be evaluated as measure alkaline phosphatase and ferritin, beyond the levels of metals Zn, Cu and Fe in the plasma of subjects. Materials and Metholds.- We developed a cross-sectional study through epidemiologic and immunological investigation (Montenegro skin tests/MST, and serological/ELISA). 36 families (170 individuals) of São Gonçalo and 129 families (480 individuals) were registered in Florestal District...

Aspectos clínico-imunológicos da Leishmania recidiva cútis (LRC) causada por Leishmania Viannia Braziliensis / Clinical and immunological aspects of Leishmania relapse skin (LRC) caused by Leishmania Viannia Braziliensis

Introdução: As leishmanioses representam um grande problema de saúde pública sendo consideradas como doença emergente e sem controle - doença de categoria 1 - e que o foco das pesquisas deve ser a aquisição de novos conhecimentos e medidas eficazes de controle. Sob o ponto de vista clínico, a leishmaniose tegumentar (LT) nas Américas apresenta as seguintes modalidades: infecção inaparente, ganglionar, cutânea localizada (LCL), cutânea disseminada (LD), cutânea difusa (LCD), recidiva cútis (LRC) e mucosa. A primeira descrição sobre LRC ocorreu na leishmaniose no Oriente com o nome “chronic lúpus-like”, definidas como lesões de aparecimento tardio e refratariedade aos tratamentos ou como uma reação peculiar do sistema imune do hospedeiro ao parasito. A LRC é uma variante da LT convencional, uma forma de cicatrização, sendo importante entender aspectos relacionados à resposta imune do hospedeiro. Objetivo: Avaliar aspectos clínico-imunológicos e terapêuticos da LRC em pacientes da região do Vale de Jiquiriçá, Bahia, Brasil. Metodologia: O estudo foi realizado no Município de Jiquiriçá, pertencente à região Sudoeste da Bahia. Os pacientes foram atendidos no ambulatório de Doenças infecciosas e Parasitárias do Centro de Referência em Doenças Endêmicas do Vale do Jiquiriçá (CERDEJJC)...

Introduction: Leishmaniasis represent a major public health problem being considered as emerging and uncontrolled disease - disease of category 1 - and the focus of research should be new knowledge and effective control measures. In relation clinical modalities, cutaneous leishmaniasis (CL) in the Americas presents the following forms: inapparent infection, lymphnode and localized cutaneous leishmaniasis (LCL), disseminated cutaneous leishmaniasis (DL), diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL), cutis recidivans leishmaniasis (CRL) and mucosal form. The first description of CRL occurred in Orient leishmaniasis called "chronic lupus-like lesions” defined as a late compromise and refractory to treatment or as a peculiar reaction of the immune response of the host to the parasite. The CRL is a variant of the conventional TL, a form of wound healing. Objective: To evaluate clinical, immunological and therapeutic aspects of the CRL in patients of the Jiquiriçá Valley region, Bahia, Brazil. Methodology: The study was conducted in Jiquiriçá municipality, belonging to southwest Bahia state. The patients were enrolled at the outpatient Infectious and Parasitic Diseases of the Reference Center for Endemic Diseases Jiquiriçá Valley (CERDEJJC)...

Avaliação do papel das células T CD8+ e análise proteômica nas Biópsias de pacientes com Leishmaniose Cutânea Localizada infectados por L. braziliensis / Assessing the role of CD8 + T cells and proteomic analysis in biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis infected by L. braziliensis Located

Células T CD8+ são essenCIaIS na defesa contra vírus, mas pouco se sabe sobre a sua participação na defesa do hospedeiro contra parasitas, como a Leishmania. Nesse trabalho, investigou-se a participação das células T CD8+ no processo inflamatório e na indução da morte do parasita, bem como os perfis proteômicos das lesões dos pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) infectados por L. braziliensis. Observa-se uma alta porcentagem de células T CD8+ nas lesões dos pacientes com LCL, como sugerido pela maior frequência de células T CD8+CD45RO+ e células T CD8+CLA + em comparação com CMSP do próprio indivíduo. Após re-estimulação com L. braziliensis, a maioria das células T CD8+ presentes na lesão expressam marcadores citolíticos, CD 107a e Granzima B. Além disso, a co-cultura de macrófagos infectados com linfócitos T CD8+ resultou na libertação de granzima B. A utilização do inibidor da granzima B, assim como Z-V AO, Fas:Fc ou anti­ IFN-y não teve nenhum efeito sobre a morte do parasita. Por outro lado, a co-cultura de macrófagos infectados com células T CD4+ diminuiu a taxa de infecção, efeito que foi completamente revertido ao se utilizar o anti-IFN-y, enfatizando o papel determinante de células T CD4+IFN-/ na morte da Leishmania. Além disso, observou-se um total de 150 proteínas diferencialmente expressas entre as lesões de pacientes com LCL e as amostras de pele normal. Destas, cinquenta e nove proteínas foram identificadas. Entre elas, 13 apresentaram uma maior ou menor expressão nas amostras dos pacientes em relação a pele normal. Vinte e sete proteínas foram encontradas somente nas lesões dos pacientes e 18 somente nas amostras de pele normal. Essas proteínas foram associadas com processos de regulação biológica; incluindo apoptose, ciclo celular e resposta imune. Para explorar as interações entre as proteínas identificadas e as proteínas e os genes que poderiam ser afetados por elas, redes e sub-redes de interações foram geradas. Após análises de imuno-histoquímica, a presença de caspas e 9, caspase-3 e granzima B foi validada no sítio da lesão. A expressão da granzima B nas lesões dos pacientes correlacionou-se positivamente com a expressão da caspase 9 e a porcentagem de células positivas para TUNEL. Observou-se também uma maior porcentagem de células postivas para TUNEL expressando granzima B nas biópsias dos pacientes que apresentam um processo mais intenso de necrose. Além disso, a presença de granzime B, caspase 9 e caspase-3 foram correlacionados positivamente com o tamanho da, lesão. Neste estudo, podemos concluir que as células T CD8+Granzima B+ estão envolvidas na patogênese da L. braziliensis, através da ativação da apoptose no sítio inflamatório, favorecendo a progressão do dano tecidual observado nos pacientes com LCL

Validação de proteínas recombinantes da leishmania infantum e da saliva do lutzomyia longipalpis como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses / Validation of recombinant proteins of Leishmania infantum and saliva of Lutzomyia longipalpis as biomarkers for serodiagnosis and assessment of exposure to leishmaniasis

O controle das populações de flebotomíneos, a contenção das epidemias nas fases iniciais e a facilitação do diagnóstico precoce dos indivíduos parasitados são estratégias traçadas pela OMS para a vigilância e controle da leishmaniose. Neste contexto, os testes sorológicos utilizando tanto o sonicado de glândula salivar (SGS) dos flebotomíneos quanto o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) são importantes ferramentas para o controle/diagnóstico das Leishmanioses. No entanto, os testes realizados a partir da utilização de antígenos obtidos de frações brutas, apesar de apresentarem alta sensibilidade, alguns destes antígenos apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos/vetores. Além disso, o preparo dos antígenos não tem adequada reprodutibilidade devido a grande dificuldade de obtenção e/ou padronização destes. No presente trabalho, objetivamos identificar biomarcadores para a vigilância e o controle das Leishmanioses, utilizando proteínas recombinantes da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores de exposição ao vetor e proteínas recombinantes da Leishmania para obtenção de um diagnóstico sorológico mais preciso para a Leishmaniose Tegumentar humana. Numa primeira etapa, foram realizados testes imunoenzimáticos contra as proteínas recombinante da saliva do vetor L. longipalpis (rLJM11 e rLJM17) para estimar a positividade anti-saliva num pequeno número de soros de crianças de uma área endêmica para Leishmaniose Visceral. Foi observado que os soros que reconhecem o SGS do L. longipalpis também reconhecem em diferentes proporções as proteínas rLJM17 e rLJM11. Ademais, as proteína recombinantes foram capazes de detectar a soroconversão anti-saliva de soros de uma segunda área endêmica para LV, havendo aumento no reconhecimento quando utilizadas as duas proteínas recombinantes de forma combinada. Além disso, a análise das curvas ROC evidenciou o desempenho superior da combinação das proteínas rLJM17 + rLJM11. Estes dados foram confirmados com a avaliação das proteínas frente um grande painel de 1.077 amostras de soro de indivíduos de uma outra área endêmica para LV. Nesta etapa, nossos resultados indicam que as proteínas rLJM11+rLJM17 representam uma ferramenta epidemiológica promissora que pode auxiliar na implementação de medidas de controle contra a Leishmaniose Visceral. Numa segunda etapa, testes imunoenzimáticos foram realizados contra uma série de proteínas recombinantes da Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, H4 e KMP11) a fim de selecionarmos proteínas antigênicas contra soros de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucosa (LM) e que apresentassem elevada especificidade quando testadas contra soros de indivíduos com outras patologias (doença de Chagas, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Hanseníase e Tuberculose). Para avaliar a eficácia das proteínas recombinantes foram utilizadas curvas ROC, possibilitando a seleção de antígenos possivelmente mais eficientes que o SLA no imunodiagnóstico da Leishmaniose. As proteínas recombinantes HSP70 e H2A foram selecionadas por apresentarem elevada sensibilidade, sendo reconhecida por anticorpos dos soros de pacientes com LM e LC respectivamente. Na última etapa dos experimentos, utilizando soros de indivíduos que apresentavam outras patologias, observou-se que a reação cruzada diminui frente aos antígenos recombinantes, especialmente para a rHSP70, quando comparamos à observada para o SLA. Nossos resultados mostram a elevada antigenicidade da rHSP70, sugerindo a possibilidade de utilização desta proteína recombinante para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar. Neste trabalho foi possível identificar e validar o uso de proteínas recombinantes do parasito e da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses.

Triagem dos antígenos recombinantes de leishmania infantum utilizando a técnica demulti-antígenos impressos(mapia) no desenvolvimento de imunodiagnóstico paraleishmaniose visceral canina / Screening of recombinant antigens Leishmaniainfantum using the technique of multi-antigen print (mapia) in developing immunodiagnostic for canine visceral leishmaniasis

As leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes protozoários do. gênero Leishmania. Estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em. áreas de risco, com uma incidência anual de aproximadamente dois milhões de. novos casos no mundo. O cão é o principal reservatório dos centros urbanos e o flebótomo é o vetor responsável por sua transmissão. No Brasil, de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde, cães soropositivos para leishmaniose devem ser sacrificado. O diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde é feito com o teste rápido DPP-LVC® para triagem e o ELISA para confirmação. Trabalhos demonstram que o DPP-LVC® não é capaz de detectar uma parcela da população de cães, o que pode contribuir para a perpetuação da doença nestas áreas. Doze proteínas recombinantes (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) foram clonadas e sequenciadas em um estudo anterior, porém não foram completamente caracterizadas quanto à antigenicidade. Nossa hipótese é que um conjunto de antígenos selecionados a partir dessas proteínas recombinantes de L. infantum poderá ampliar a identificação de animais infectados em áreas endêmicas. O objetivo deste estudo foi identificar um conjunto de antígenos recombinantes de L. infantum, a partir de 12 antígenos previamente selecionados, quanto ao reconhecimento por soros de cães infectados para futuramente compor um teste imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina. No presente estudo, os 12 antígenos recombinantes previamente selecionados foram produzidos em nosso laboratório e purificados em Bio-Manguinhos. O ensaio de MAPIA (Multi-Antigen Print ImmunoAssay), que consiste em uma plataforma de triagem de antígenos em papel de nitrocelulose, mais próxima do teste rápido DPP-LVC®, foi utilizado para avaliação do reconhecimento dos 12 antígenos recombinantes por soros de cães infectados. Na triagem foram utilizados soros caninos positivos para leishmaniose visceral (n = 39), obtidos em estudo epidemiológico de corte transversal em área endêmica. Para avaliação da reatividade cruzada foram utilizados soros de cães com outras patologias: leishmaniose tegumentar (n = 10), tripanossomíase canina (n = 10), babesiose (n = 10) e erliquiose (n = 11), além de soros de animais negativos (n = 40). Inicialmente, foi definido o melhor protocolo para ser utilizado nos ensaios de MAPIA. Posteriormente, a triagem dos antígenos foi realizada com os soros e, para avaliar, a confiabilidade dos resultados obtidos, os testes foram lidos por dois observadores de maneira independente. A concordância entre as leituras visuais dos dois observadores foi avaliada utilizando o índice Kappa. O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar diferenças estatísticas entre o índice de positividade das proteínas avaliadas. As proteínas Lci1A e Lci2B foram reconhecidas por 74% e 69%, respectivamente. As Lci4, Lci5 e Lci12 obtiveram reconhecimento de 33%, 31% e 33%, respectivamente pelos anticorpos presentes nos soros. Baixa reatividade dos soros de cães com babesiose, erliquiose, tripanossomíase canina foi observada com as 12 proteínas recombinantes avaliadas. Soros de cães com leishmaniose tegumentar foram os que apresentaram mais reatividade com as proteínas recombinantes. Analises combinatórias foram realizadas para identificar a partir dos 12 antígenos previamente selecionados, o conjunto destes capaz de identificar o maior número de soros de cães com leishmaniose visceral canina testados...

Leishmaniasis is an antropozoonosis caused by different protozoa of the genus Leishmania. It is estimated that approximately 350 million of people are at risk areas, with annual incidence of approximately two million new cases worldwide. The dog is the main reservoir in urban centers and the sandfly is the vector responsible for transmission. In Brazil, according to the recommendations of the Ministry of Health, seropositive dogs for leishmaniasis should be euthanized. The diagnosis is made by the DPP-LVC® as screening and ELISA as confirmatory. Studies have shown that DPP-LVC® is not able to detect a portion of the dog population, which may contribute to the perpetuation of the disease in these areas. Twelve recombinant proteins (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) were cloned and sequenced in a previous study, but were not fully characterized for antigenicity. Our hypothesis is that a set of selected recombinant antigens of L. infantum may increase the identification of infected animals in endemic areas. The aim of this study was identify a set of recombinant antigens of L. infantum from 12 previously selected for recognition by sera from infected dogs to compose an immunodiagnostic test for canine visceral leishmaniasis. The 12 recombinant antigens were produced in our laboratory and purified in Bio-Manguinhos. MAPIA (Multi-Antigen Print ImmunoAssay), which consists in a screening platform for antigen in nitrocellulose paper, was used to assess the recognition of recombinant antigens for 12 sera of dogs infected. MAPIA is closer to rapid test DPP-CVL® than other screening tests. We used this screening method with sera positive for canine visceral leishmaniasis (n = 39) obtained in a cross-sectional epidemiological study in endemic area. For evaluation of cross-reactivity, sera from dogs with other diseases: cutaneous leishmaniasis (n = 10), canine trypanosomiasis (n = 10) babesiosis (n = 10) and ehrlichiosis (n = 11), and animal sera negative (n = 40) were used. Initially, was decided that the best protocol to be used in the assays. Subsequently, screening of antigens was performed with sera and to evaluate the reliability of the results, the tests were read by two observers independently. The agreement between visual readings of the two observers was assessed using the kappa index...

Identificação dos criadouros naturais de Lutzomyia longipalpis (DIPTERA: PSYCHODIDAE)em área endêmica para a Leishmaniose Visceral, do estado da Bahia, Brasil / Identification of the natural breeding of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) in an endemic area for visceral leishmaniasis, the state of Bahia, Brazil

Até o momento poucos microhábitats foram identificados como criadouros naturais de flebotomíneos, tendo maior sucesso trabalhos em regiões de clima úmido. O presente estudo, realizado em uma região de clima semiárido, investigou a ocorrência de criadouros naturais em uma série de microhábitats selecionados de acordo com a presença de umidade e matéria orgânica, além de redução de luminosidade. METODOS: 64 amostras de solo foram mensalmente coletadas no ambiente peridomiciliar ou intradomiciliar de cinco casas localizadas em Cavunge, distrito do município de Ipecaetá, uma região do semiárido do estado da Bahia, sendo analisada a emersão de flebotomíneos adultos pelas técnicas de observação direta e formas imaturas pela técnica de flutuação. Capturas de flebotomíneos adultos foram também realizadas, dispondo mensalmente armadilhas luminosas nos ambientes peridomiciliar e intradomiciliar. Das 1523 amostras de solo coletadas, 49 foram positivas para criadouros naturais, sendo encontrado um total de 64 flebotomíneos, a maioria (n = 40) pertencentes a espécie Lutzomyia longipalpis, encontradas principalmente em microhabitats como concavidades rochosas e em ocos de árvores. Dos 2002 flebotomíneos adultos capturados e identificados, a maioria (n = 1907) pertenceu a espécie L. longipalpis. Nas relações entre as variáveis climáticas e a emergência de flebótomos e os flebótomos capturados, observou-se uma relação de força moderada, e estatisticamente significativa na temperatura entre uma semana anterior à captura entomológica e densidade de flebótomos, indicando que para uma região semiárida este parâmetro climático é o mais apropriado na previsão de quantidade de formas adultas de flebotomíneos. Em conjunto, nossos resultados tanto acerca da caracterização dos criadouros naturais de flebotomíneos, quanto sua relação com variáveis climáticas, poderá servir como uma ferramenta auxiliar no direcionamento do controle biológico e controle da leishmaniose.

Detecção de formas amastigotas em exame parasitológico de esfregaço obtido a partir de suabe conjuntival de cães com leishmaniose visceral / Detection of amastigote forms in a parasitological exam of smears made from conjuntival swab in dogs with visceral leishmaniasis

Leishmaniose é uma enfermidade multissistêmica cujas manifestações clínicas são extremamente variáveis. Em cães sinais clínicos oftálmicos são relativamente frequentes, ainda que outros sinais sistêmicos não sejam identificados. Atualmente, o diagnóstico da doença baseia-se em métodos parasitológicos, sorológicos e moleculares, mas, até o momento, a identificação de formas amastigotas desse parasito em esfregaços feitos a partir de suabes conjuntivais não é empregada rotineiramente. Valendo-se de cães sorologicamente positivos para leishmaniose, portadores (G1) ou não (G2) de alterações oftálmicas, este estudo avaliou a viabilidade do esfregaço a partir de suabe conjuntival como método de diagnóstico para a enfermidade. O exame suprarreferido foi positivo em 60% dos animais do G1 e 38,1% do G2, no entanto não houve diferença estatisticamente significativa em relação à positividade nos dois grupos (P=0,2167). Os dados apontam para uma tendência de os cães com leishmaniose e com sinais oftálmicos serem positivos ao exame parasitológico de esfregaço a partir de suabe conjuntival, podendo esse método ser útil no diagnóstico parasitológico da leishmaniose canina.

Leishmaniasisis is a multisystemic disease with varying clinical presentations. In dogs, alterations in the eyes are commonly observed even in animals with no systemic signs. The diagnosis of leishmaniasis is currently based on parasitological, serological and molecular methods, although the identification of amastigote forms of this parasite in conjunctival swabs is not a routine technique in clinical practice. Serologically positive dogs for leishmaniasis presenting (G1) or not (G2) ocular alterations were enrolled in this study to evaluate the conjunctival swab as a method for the diagnosis of this disease. The parasitological evaluation of the swabs disclosed 60% positivity for dogs in group 1, whereas only 38.1% of dogs in group 2 were positive. However, no significant difference was documented between the two groups (P=0.2167). Our data suggest a tendency for dogs with ocular signs to be tested positive in the conjunctival swab exam, thus, this method is useful in the diagnosis of canine leishmaniasis.

Diagnóstico de la leishmaniasis: de la observación microscópica del parásito a la detección del ADN / Leishmaniasis diagnosis: going from microscopic observation of parasite to DNA detection

Introducción: la leishmaniasis es una enfermedad causada por varias especies del género Leishmania, de la cual se han incrementado los reportes en los últimos años. Diversos factores genéticos, inmunológicos y asociados al parásito determinan el establecimiento de la infección y la ocurrencia de enfermedad, que se presenta en formas clínicas muy diversas, lo cual condiciona, entre otros elementos, el método diagnóstico que se aplica. Métodos: se hizo una revisión de la literatura básica y actualizada sobre aspectos generales de la leishmaniasis: la enfermedad y su situación epidemiológica, el ciclo de vida y la transmisión, vectores, presentaciones clínicas y diagnóstico; este último acápite contiene información sobre los principales métodos que se utilizan en el presente. Se puntualizó en la forma en que se apoya el diagnóstico desde el grupo de Leishmania del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", que constituye el centro nacional de referencia para esta enfermedad tropical. Resultados: se muestra información actualizada sobre los temas escogidos, con un enfoque orientador y práctico, dirigido al personal de salud que debe enfrentar casos con sospecha de leishmaniasis. Se muestran tablas y gráficos que resumen de manera organizada aspectos relevantes, así como el algoritmo de trabajo que se sigue en el instituto con relación al diagnóstico de esta enfermedad, con énfasis especial en las aplicaciones al diagnóstico molecular que ha realizado el grupo de trabajo. Conclusiones: debido a que la leishmaniasis permanece aún sin control, el diagnóstico oportuno continúa siendo una necesidad. Todos los métodos aportan información de utilidad para la toma de decisiones en el tratamiento clínico, la imposición del tratamiento y el enfoque epidemiológico de esta parasitosis. Entre ellos, proponemos un algoritmo de trabajo en nuestro laboratorio, con el empleo de los métodos que resultan más útiles de acuerdo a nuestras condiciones y experiencias.

Introduction: leishmaniasis is a disease caused by several species from Leishmania genus, which has been increasingly reported in the last few years. Several genetic, immunological factors and others related to this parasite have been associated to the outcome of the infection, and the occurrence of illness in varied clinical forms. All the aforementioned has an impact on the diagnostic method that should be used. Methods: a basic and recent literature review was made, mainly focused on general aspects of leishmaniasis as epidemiological situation of disease, life cycle and transmission, vectors, clinical presentation and diagnosis; the latter shows information about the main methods used at present. The procedure followed by the Leishmania group at "Pedro Kourí" Institute of Tropical Medicine to support the diagnostic activities was presented as well. Results: updated practical information about the chosen topics was presented, with a practical guiding approach aimed at the health personnel that must face suspected leishmaniasis cases. Tables and figures summarized relevant aspects in an organized form, as well as the working algorithm of Institute concerning diagnosis was presented. The application of molecular diagnosis by this working team was particularly underlined. Conclusions: as leishmaniasis is still out of control, opportune diagnosis remains a must. All the methods provide useful information for taking decisions on clinical management, treatment and epidemiology of this parasitosis; hence, a working algorithm was submitted in our lab based on the most useful methods under our present conditions and experience.

Avaliação de atividade antileishmania de fármacos antimaláricos in vitro e em modelo murino de leishmaniose tegumentar / Evaluation of antileishmanial activity of antimalarial drugs in vitro and in a murine model of cutaneous leishmaniasis

A leishmaniose compreende um complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, e é endêmica em 88 países, com uma população de 350 milhões de indivíduos sob o risco de contrair a infecção. O tratamento convencional da leishmaniose é realizado com antimoniais pentavalentes, e está associado a inúmeros efeitos adversos e falha terapêutica. Dessa forma, a busca por novas alternativas terapêuticas para esta doença é de extrema relevância. O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade antileishmania de fármacos antimaláricos in vitro e em modelo murino de leishmaniose tegumentar causada por Leishmania amazonensis. Os fármacos antimaláricos testados foram o artesunato, a cloroquina, a hidroxicloroquina, a mefloquina e a primaquina. Destes, a cloroquina e a hidroxicloroquina não reduziram, de forma significativa, o crescimento de formas promastigotas do parasito na concentração de 50 μM. Entretanto, estes dois fármacos foram eficazes em reduzir o número de amastigotas em macrófagos murinos, apresentando valores de IC50 de 0,78 ± 0,08 μM e 0,67 ± 0,12 μM, respectivamente. A mefloquina apresentou valor de IC50 de 8,4 ± 0,70 μM contra promastigotas do parasito, enquanto que, contra formas amastigotas o IC50 foi 1,56 ± 0,19 μM. A análise ultraestrutural de células infectadas e tratadas com a cloroquina ou com a mefloquina mostrou o acúmulo de corpos multivesiculares no citoplasma do parasito. Este resultado sugere o comprometimento da via endocítica da Leishmania após o tratamento com estas moléculas. O tratamento oral de camundongos CBA infectados com L. amazonensis reduziu a lesão e o parasitismo nos animais infectados. Diferente destes resultados, o tratamento com a mefloquina não reduziu o parasitismo nos animais infectados, apesar de ter reduzido o tamanho da lesão. Com base nestes resultados é possível concluir que a cloroquina pode representar uma alternativa terapêutica ao tratamento convencional da leishmaniose tegumentar.

Aplicação de técnica sorológicas e moleculares na detecção de leishmania em doadores de sangue na cidade de Salvador, Bahia / Application of serological and molecular technique in the detection of Leishmania in blood donors in Salvador, Bahia

A leishmaniose é causada por protozoários do gênero Leishmania e constitui um problema grave de saúde pública na Bahia. A transmissão do protozoário pela transfusão de sangue já foi relatada e existe a possibilidade dos hemoderivados serem um potencial risco para a manutenção da doença. O presente trabalho teve como objetivo avaliar positividade sorológica contra Leishmania e a presença deste parasita no sangue periférico de doadores, na cidade de Salvador, BA. Para estipulando a soroprevalência de leishmaniose em doadores de sangue, foram coletadas amostras de sangue periférico de 700 indivíduos, no Hemocentro da Bahia (HEMOBA/SESAB), de janeiro a setembro de 2010. As amostras foram processadas para a obtenção de plasma e de DNA. A sorologia anti-Leishmania foi feita por ELISA, empregando antígeno solúvel de Leishmania chagasi (SLA). A presença de parasitas foi determinada por PCR qualitativo e por PCR quantitativo (qPCR). A população amostral foi composta por 74.5% de indivíduos masculinos, com média de idade de 34 anos. A partir de uma curva ROC, empregando soros de pacientes com leishmaniose visceral e soros de pacientes residentes em área não endêmica, o ponto de corte para o teste sorológico foi estabelecido em 0,0167 (DO em 405nm). A sorologia anti-Leishmania foi positiva em 5.4% (38/700) das amostras. Destes indivíduos, 73% (28/38) apresentaram amplificação para uma região repetitiva do genoma de Leishmania, empregando-se o PCR qualitativo. Empregando o qPCR, foi possível determinar a presença de parasitas em 0.4% (3/700) amostras e, nestas, a quantificação foi inferior a 10 parasitas. Nossos resultados mostram a prevalência de sorologia anti-Leishmania é de 5.4%, em doadores do HEMOBA/SESAB, similar ao encontrado em outras área onde ocorre a leishmania.

Levantamento da fauna de flebotomíneos, vetores de leishmanioses, na Ilha de Marambaia, município de Mangaratiba, Rio de Janeiro, Brasil / Survey of sandflies, vectors of Leishmaniasis, in Marambaia Island, municipality of Mangaratiba, Rio de Janeiro State, Brazil

Consideradas antropozoonoses, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é representada pelas formas dermotrópicas, enquanto a leishmaniose visceral americana é representada pela forma viscerotrópica. Essas antropozoonoses são transmitidas de hospedeiros reservatórios silvestres, sinantrópicos ou domésticos ao homem e a outros animais, pela picada de dípteros da família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, conhecidos como flebotomíneos. Esta dissertação é resultado de um estudo na Ilha da Marambaia, Município de Mangaratiba, Estado do Rio de Janeiro; local que abriga uma comunidade descendente de quilombolas e onde há um deslocamento nacional e internacional de militares de possíveis áreas endêmicas de leishmanioses. O presente estudo consistiu em realizar o levantamento da fauna flebotomínica do Centro de Adestramento da Ilha da Marambaia (CADIM), avaliar a sazonalidade das espécies de importância epidemiológica na transmissão das leishmanioses e avaliar a distribuição destas espécies nos diferentes ecótopos. Foram coletadas 13 espécies de flebotomíneos: Nyssomyia intermedia, Migoneimyia migonei, Pintomyia fischeri, Lutzomyia longipalpis, Evandromyia edwardsi, Pintomyia bianchigalatiae, Brumptomyia brumpti, Evandromyia cortellezii, Expapillata firmatoi, Micropygomyia capixaba, Micropygomyia quinquefer, Micropygomyia schreiberi, e Psathyromyia pelloni; com um total de 32.006 espécimes capturados...

American tegumentary leishmaniasis (ATL) and American visceral leishmaniasis (AVL), are considered antropozoonoses. It is transmitted from reservoir hosts wild, synanthropic or domestic to humans and other animals by biting insects of the family Psychodidae, subfamily Phlebotominae, known as sandflies. This dissertation is the result of a study in Marambaia Island, Municipality of Mangaratiba, States of Rio de Janeiro. This place community that houses a descendant of quilombolas and where there is a shift of national and international military of possible areas of endemic leishmaniasis. The present study was to survey the sand flies of the Training Center Marambaia Island (CADIM), to determine the seasonality of the species of epidemiological importance in the transmission of leishmaniasis and evaluate the distribution of these species in different ecotopes. 13 species of sandflies were collected: Nyssomyia intermedia, Migoneimyia migonei, Pintomyia fischeri, Lutzomyia longipalpis, Evandromyia edwardsi, Pintomyia bianchigalatiae, Brumptomyia brumpti, Evandromyia cortellezii, Expapillata firmatoi, Micropygomyia capixaba, Micropygomyia quinquefer, Micropygomyia schreiberi, e Psathyromyia pelloni; with a total of 32.006 specimens captured...

Evaluacion por Western blot, inmunofluorescencia indirecta y ELISA de perros infectados con Leishmania (Leishmania) infantum / Western blot, ELISA and indirect immunofluorescence test evaluation of Leishmania (Leishmania) infantum-infected dogs

Objetivo Evaluar el desempeño de las pruebas empleadas en Colombia para el diagnóstico de la leishmaniasis visceral canina y adaptar una técnica de Western blot empleando animales experimental y naturalmente infectados. Metodología Se obtuvieron sueros de 10 perros infectados experimentalmente con L. infantum, 5 perros infectados naturalmente, 16 perros sanos, 26 de reacción cruzada (infectados con Babesia canis, Erhlichia canis, Dirofilaria immitis, Trypanosoma cruzi, Leishmania (Viannia) spp.), 40 de zonas no endémicas y 150 de zona endémica. Todos fueron evaluados mediante las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA y Western blot (WB). Resultados Se encontró que IFI tuvo el mayor porcentaje de positividad en los perros infectados (73 por ciento) mientras que el menor porcentaje de falsos positivos se obtuvo por WB (2,5 por ciento). La prueba de ELISA fue la menos eficiente. Fueron reconocidas 24 fracciones antigénicas, las bandas de 29, 34, 50, 69, 75, 86, 99 y 123 kDa fueron responsables de reacciones inespecíficas en los sueros de perros sanos, de zona no endémica y de reacción cruzada. Las bandas por debajo de 29 kDa mostraron ser potencialmente diagnósticas, especialmente la fracción de 13 kDa. Conclusiones Los métodos directos y serológicos pueden subdiagnosticar la infección por Leishmania, solamente un constructo que combine tanto pruebas directas como indirectas sería la forma más eficiente de diagnóstico.

Objective Evaluating canine visceral leishmaniasis diagnostic test performance in Colombia and adapting the Western blot test in naturally and experimentally infected dogs. Methods Sera were obtained from 10 experimentally L. Infantum-infected dogs, 5 naturally infected dogs, 16 healthy dogs, 26 Babesia canis, Erhlichia canis, Dirofilaria immitis, Trypanosoma cruzi and Leishmania (Viannia) spp infected dogs, 40 dogs from non-endemic areas and 150 from endemic areas. Sera were tested for L. infantum infection using immunofluorescent antibody (IFAT), ELISA and Western blot (WB) tests. Results Positives results were obtained for 73 percent of known infected dogs by the IFAT test and false positives were obtained for 2.5 percent of non-infected dogs using WB. ELISA was not efficient for diagnosis. 24 antigenic fractions were recognised in tested sera using WB; however, 29, 34, 50, 69, 75, 86, 99 and 123 kDa bands were recognised in sera from dogs from non-endemic areas, healthy dogs and Trypanosoma cruzi, Erhlichia canis, Dirofilaria immitis and Babesia canis infected dogs. The 13 kDa fraction proved potentially useful for diagnosing canine visceral leishmaniasis. ConclusionsThe separate use of parasitological and serological test could lead to misdiagnosis of Leishmania infection; using both kinds of technique simultaneously is thus highly recommended.